MONITORUL OFICIAL AL ROMANIEI

 

P A R T E A  I

Anul 175 (XIX) - Nr. 524         LEGI, DECRETE, HOTĂRÂRI SI ALTE ACTE         Joi, 2 august 2007

 

SUMAR

 

HOTĂRÂRI ALE GUVERNULUI ROMÂNIEI

 

718. - Hotărâre privind aprobarea Acordului dintre Guvernul României si Guvernul Republicii Ungare, semnat la Bucuresti la 21 decembrie 2006, pentru aplicarea Conventiei dintre România si Republica Ungară privind controlul traficului de frontieră rutier si feroviar, semnată la Bucuresti la 27 aprilie 2004

           

Acord între Guvernul României si Guvernul Republicii Ungare pentru aplicarea Conventiei dintre România si Republica Ungară privind controlul traficului de frontieră rutier si feroviar, semnată la Bucuresti la 27 aprilie 2004

 

747. - Hotărâre privind reglementarea actiunilor specifice aferente finantării asistentei din cadrul politicii nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare

 

ACTE ALE ORGANELOR DE SPECIALITATE ALE ADMINISTRATIEI PUBLICE CENTRALE

 

586. - Ordin al ministrului agriculturii si dezvoltării rurale privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

 

762. - Ordin al ministrului economiei si finantelor privind modificarea Instructiunilor pentru stabilirea procedurii privind efectuarea operatiunilor necesare pentru finantarea de la bugetul de stat în cazul indisponibilitătii temporare a contributiei financiare a Comunitătii Europene si în cazul compensărilor efectuate de Comisia Europeană, precum si pentru tratamentul dobânzii acumulate în conturile bancare ale Fondului National în cadrul programelor ISPA, aprobate prin Ordinul ministrului finantelor publice nr. 296/2007

 

832/1.215/347/146. - Ordin al ministrului agriculturii si dezvoltării rurale, al ministrului sănătătii publice, al presedintelui Autoritătii Nationale pentru Protectia Consumatorilor si al presedintelui Autoritătii Nationale Sanitare Veterinare si pentru Siguranta Alimentelor privind modificarea anexei nr. 2 la Normele cu privire la natura, continutul, fabricarea, calitatea, ambalarea, etichetarea, marcarea si păstrarea sucurilor de legume, aprobate prin Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor, al ministrului sănătătii si familiei si al presedintelui Autoritătii Nationale pentru Protectia Consumatorilor nr. 359/671/137/2002

 

1.252. - Ordin al ministrului sănătătii publice privind stabilirea cuantumului sumei de participare la concursul organizat pentru ocuparea postului de manager general, persoană fizică, din serviciile de ambulantă judetene si al municipiului Bucuresti

 

HOTĂRÂRI ALE GUVERNULUI ROMÂNIEI

 

GUVERNUL ROMÂNIEI

 

HOTĂRÂRE

privind aprobarea Acordului dintre Guvernul României si Guvernul Republicii Ungare, semnat la Bucuresti la 21 decembrie 2006, pentru aplicarea Conventiei dintre România si Republica Ungară privind controlul traficului de frontieră rutier si feroviar, semnată la Bucuresti la 27 aprilie 2004

 

În temeiul art. 108 din Constitutia României, republicată, si al art. 20 din Legea nr. 590/2003 privind tratatele,

 

Guvernul României adoptă prezenta hotărâre.

 

Articol unic. - Se aprobă Acordul dintre Guvernul României si Guvernul Republicii Ungare, semnat la Bucuresti la 21 decembrie 2006, pentru aplicarea Conventiei dintre România si Republica Ungară privind controlul traficului de frontieră rutier si feroviar, semnată la Bucuresti la 27 aprilie 2004, ratificată prin Legea nr. 191/2005.

 

PRIM-MINISTRU

CALIN POPESCU-TĂRICEANU

Contrasemnează:

p. Ministrul internelor si reformei administrative,

Liviu Radu,

secretar de stat

Ministrul transporturilor,

Ludovic Orban

Ministrul afacerilor externe,

Adrian Mihai Cioroianu

Ministrul economiei si finantelor,

Varujan Vosganian

 

Bucuresti, 4 iulie 2007.

Nr. 718.

 

ACORD

între Guvernul României si Guvernul Republicii Ungare pentru aplicarea Conventiei dintre România si Republica

Ungară privind controlul traficului de frontieră rutier si feroviar, semnată la Bucuresti la 27 aprilie 2004

 

În conformitate cu prevederile art. 3 alin. (4) din Conventia dintre România si Republica Ungară privind controlul traficului de frontieră rutier si feroviar, semnată la Bucuresti la 27 aprilie 2004, denumită în continuare Conventie,

Guvernul României si Guvernul Republicii Ungare, denumite în continuare părti contractante,

în scopul facilitării punerii în aplicare a Conventiei,

în vederea accelerării si simplificării controlului traficului la frontiera de stat comună prin intermediul colaborării dintre autoritătile tor,

având în vedere Concluziile Parlamentului European si ale Consiliului adoptate la 27 noiembrie 2003, referitoare la aprobarea conventiilor bilaterale de cooperare privind controlul persoanelor la frontierele comune de uscat ale unor state membre ale Uniunii Europene în urma extinderii, precum si dispozitiile referitoare la controalele comune prevăzute în Codul comunitar asupra regulilor privind circulatia persoanelor peste frontiere (denumit în continuare Codul frontierelor Schengen), stabilit prin Regulamentul Parlamentului European si al Consiliului nr. 562/2006/CE,

au convenit următoarele:

 

CAPITOLUL I

Dispozitii generale

 

ARTICOLUL 1 (1)

 

În scopul celor de mai sus, părtile contractante convin să controleze împreună, în cadrul unei singure opriri, persoanele care trec frontiera prin punctele rutiere de trecere a frontierei româno-maghiare, precum si obiectele aflate în proprietatea acestora si mijloacele de transport. În cursul controlului comun la o singură oprire, efectuat potrivit dispozitiilor art. 7 din Codul frontierelor Schengen, autoritătile competente ale părtilor contractante efectuează controlul în cadrul propriei lor sfere de atributii.

(2) Expresiile utilizate în prezentul acord au sensul stabilit în Conventie.

(3) Autoritătile competente ale părtilor contractante se informează reciproc asupra modernizării punctelor de trecere a frontierei care implică si cealaltă parte contractantă, respectiv asupra limitărilor, devierilor provizorii de trafic si asupra lucrărilor care implică locurile de serviciu, cu suficient timp înaintea începerii acestora.

(4) Părtile contractante stabilesc în scris si publică, conform legislatiei lor interne, drumurile care traversează frontiera de stat pe care pot fi transportate mărfuri periculoase.

(5) În cursul punerii în aplicare a prezentului acord, limbile de contact între persoanele de serviciu sunt limbile română si maghiară. Cu ocazia mentinerii legăturii, personalul de serviciu poate conveni si asupra folosirii unei alte limbi.

 

ARTICOLUL 2

 

(1) Controlul traficului de frontieră în traficul feroviar se efectuează în stationare, pe timpul stationării trenului în punctul de trecere a frontierei.

(2) La punctele feroviare de trecere a frontierei, personalul de serviciu al fiecărei părti contractante efectuează separat controlul traficului de frontieră, pe teritoriul propriului său stat.

(3) În vederea fluidizării controlului traficului feroviar al persoanelor, respectiv al circulatiei feroviare, precum si în scopul reducerii timpului de asteptare, părtile contractante pot conveni asupra controlului comun, din mers, al traficului feroviar de persoane, asupra regulilor detaliate si conditiilor controlului, în primul rând pe tronsoanele de cale ferată dintre statiile feroviare Arad-Curtici (Kurtos) – Lökösháza - Békéscsaba, precum si dintre Oradea (Nagyvárad)-Episcopia Bihorului (Biharpüspöki)- Biharkeresztes – Püspökladány. 

 

ARTICOLUL 3

 

(1) Autoritătile de control al traficului de frontieră ale părtilor contractante vor stabili printr-o întelegere regulile privind regimul de functionare a punctelor de trecere a frontierei.

(2) Întelegerea privind regimul functionării punctelor de trecere a frontierei trebuie să cuprindă următoarele:

a) regulile primirii autovehiculelor;

b) locul sl regulile controlului;

c) alte conditii necesare efectuării controlului (cum ar fi scoaterea de sub tensiune a garniturilor de tren);

d) modul de întoarcere la frontiera comună a persoanelor si bunurilor;

e) locul de control al mărfurilor periculoase si transporturilor de animale vii;

f) regulile privind măsurile necesare în cazul unor accidente grave sau al altor evenimente deosebite petrecute la punctul de trecere a frontierei;

g) modul de amplasare a inscriptiilor informative pe teritoriul punctului de trecere a frontierei;

h) regulile referitoare la prevenirea si eliminarea încălcării dispozitiilor stabilite în regulamentul punctului de trecere a frontierei;

i) parcările de serviciu desemnate.

 

CAPITOLUL II

Puncte de trecere rutiere a frontierei comune

 

ARTICOLUL 4

Cenad (Nagycsanád) – Kiszombor

 

(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru traficul international de persoane, precum si pentru traficul international de mărfuri, până la limita de greutate totală de 7,5 tone.

(2) Controlul traficului international de persoane care ies de pe teritoriul Republicii Ungare si intră pe teritoriul României prin punctul de trecere rutier Cenad (Nagycsanád) - Kiszombor - inclusiv controlul persoanelor participante la traficul international de mărfuri - are loc pe teritoriul României, într-un loc comun, în acest scop pe teritoriul României se înfiintează un loc de serviciu maghiar pentru controlul traficului de frontieră.

(3) Controlul traficului international de persoane care ies de pe teritoriul României si intră pe teritoriul Republicii Ungare - inclusiv controlul persoanelor participante la traficul international de mărfuri - are loc pe teritoriul Republicii Ungare, într-un loc comun. În acest scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român pentru controlul traficului de frontieră.

(4) Programul de lucru al punctului de trecere a frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.

(5) Pentru personalul de serviciu maghiar, teritoriul de functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră, existent pe teritoriul României, se extinde asupra:

a) încăperilor de serviciu desemnate, încăperilor comune;

b) drumului public care duce de la frontiera de stat la locul de serviciu;

c) benzilor de circulatie de control;

d) parcării de serviciu.

(6) Pentru personalul de serviciu român, teritoriul de functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră, existent pe teritoriul Republicii Ungare, se extinde asupra:

a) încăperilor de serviciu desemnate, încăperilor comune;

b) drumului public care duce de la frontiera de stat la locul de serviciu;

c) benzilor de circulatie de control;

d) parcării de serviciu.

(7) În cazul creării conditiilor necesare de personal, tehnice si de infrastructură, părtile contractante autorizează traficul international de mărfuri prin punctul de trecere a frontierei, până la limita unei greutăti totale de 12,5 tone, despre a cărui introducere se va conveni pe cale diplomatică.

 

ARTICOLUL 5

Nădlac (Nagylak) – Nagylak

 

(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru traficul international de persoane si de mărfuri.

(2) Controlul traficului de persoane care ies de pe teritoriul Republicii Ungare si intră pe teritoriul României prin punctul de trecere rutier de la Nădlac (Nagylak} - Nagylak are loc pe teritoriul României, într-un loc comun. In acest scop pe teritoriul României se înfiintează un loc de serviciu maghiar pentru controlul traficului de frontieră.

(3) Controlul traficului international de persoane care ies de pe teritoriul României si intră pe teritoriul Republicii Ungare are loc pe teritoriul Republicii Ungare, într-un loc comun. In acest scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român pentru controlul traficului de frontieră.

(4) Controlul persoanelor participante la traficul international de mărfuri la punctul de trecere a frontierei indicat la alin. (1) are loc într-un loc comun pe teritoriul Republicii Ungare. În acest scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român pentru controlul traficului de frontieră.

(5) Programul de lucru al punctului de trecere a frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.

(6) Pentru personalul de serviciu maghiar, teritoriul de functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră, existent pe teritoriul României, se extinde asupra:

a) încăperilor de serviciu desemnate, încăperilor comune;

b) drumului public care duce de la frontiera de stat la locul de serviciu;

c) benzilor de circulatie de control;

d) parcării de serviciu.

(7) Pentru personalul de serviciu român, teritoriul de functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră, existent pe teritoriul Republicii Ungare, se extinde asupra:

a) încăperilor de serviciu desemnate, încăperilor comune;

b) drumului public care duce de la frontiera de stat la locul de serviciu;

c) benzilor de circulatie de control si cabinelor de serviciu aferente acestora, atât pe terminalul de iesire, cât si de intrare;

d) parcării de serviciu.

 

ARTICOLUL 6

Turnu (Tomya) – Battonya

 

(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru traficul international de persoane, precum si pentru traficul international de mărfuri, până la limita de greutate totală de 7,5 tone.

(2) Controlul traficului de persoane care ies de pe teritoriul Republicii Ungare si intră pe teritoriul României prin punctul de trecere rutier Turnu (Tomya) - Battonya - inclusiv controlul persoanelor participante la traficul international de mărfuri - are loc pe teritoriul României, într-un loc comun. În acest scop pe teritoriul României se înfiintează un loc de serviciu maghiar pentru controlul traficului de frontieră.

(3) Controlul traficului international de persoane care ies de pe teritoriul României si intră pe teritoriul Republicii Ungare - inclusiv controlul persoanelor participante la traficul international de mărfuri - are loc pe teritoriul Republicii Ungare, într-un loc comun. În acest scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român pentru controlul traficului de frontieră.

(4) Programul de lucru al punctului de trecere a frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.

(5) Pentru personalul de serviciu maghiar, teritoriul de functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră, existent pe teritoriul României, se extinde asupra:

a) încăperilor de serviciu desemnate, încăperilor comune;

b) drumului public care duce de la frontiera de stat la locul de serviciu;

c) benzilor de circulatie de control;

d) parcării de serviciu.

(6) Pentru personalul de serviciu român, teritoriul de functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră, existent pe teritoriul Republicii Ungare, se extinde asupra:

a) încăperilor de serviciu desemnate, încăperilor comune;

b) drumului public care duce de la frontiera de stat la locul de serviciu;

c) benzilor de circulatie de control;

d) parcării de serviciu.

 

ARTICOLUL 7

Vărsând (Gyulavarsánd) – Gyula

 

(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru traficul international de persoane si de mărfuri.

(2) Controlul traficului de persoane care ies de pe teritoriul Republicii Ungare si intră pe teritoriul României pe la punctul de trecere rutier Vărsând (Gyulavarsănd) - Gyula are loc pe teritoriul României, într-un loc comun. În acest scop pe teritoriul României se înfiintează un loc de serviciu maghiar pentru controlul traficului de frontieră.

(3) Controlul traficului international de persoane care ies de pe teritoriul României si intră pe teritoriul Republicii Ungare are loc pe teritoriul Republicii Ungare, într-un loc comun. În acest scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român pentru controlul traficului de frontieră.

(4) Controlul persoanelor participante la traficul international de mărfuri la punctul de trecere a frontierei indicat la alin. (1) are loc într-un loc comun de pe teritoriul Republicii Ungare. În acest scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român pentru controlul traficului de frontieră.

(5) Programul de lucru al punctului de trecere a frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.

(6) Pentru personalul de serviciu maghiar, teritoriul de functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră, existent pe teritoriul României, se extinde asupra:

a) încăperilor de serviciu desemnate, încăperilor comune;

b) drumului public care duce de la frontiera de stat la locul de serviciu;

c) benzilor de circulatie de control;

d) parcării de serviciu.

(7) Pentru personalul de serviciu român, teritoriul de functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră, existent pe teritoriul Republicii Ungare, se extinde asupra:

a) încăperilor de serviciu desemnate, încăperilor comune;

b) drumului public care duce de la frontiera de stat la locul de serviciu;

c) benzilor de circulatie de control si cabinelor de serviciu aferente acestora, atât pe terminalul de iesire, cât si de intrare;

d) parcării de serviciu.

 

ARTICOLUL 8

Salonta (Nagyszalonta) – Méhkerék

 

(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru traficul international de persoane, precum si pentru traficul international de mărfuri, până la limita de greutate totală de 7,5 tone.

(2) Controlul traficului de persoane care ies de pe teritoriul Republicii Ungare si intră pe teritoriul României pe la punctul de trecere rutier de la Salonta (Nagyszalonta) - Mehkerek - inclusiv controlul persoanelor participante la traficul international de mărfuri - are loc pe teritoriul României, într-un loc comun, în acest scop pe teritoriul României se înfiintează un loc de serviciu maghiar pentru controlul traficului de frontieră.

(3) Controlul traficului international de persoane care ies de pe teritoriul României si intră pe teritoriul Republicii Ungare - inclusiv controlul persoanelor participante la traficul international de mărfuri - are loc pe teritoriul Republicii Ungare, într-un loc comun. În acest scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român pentru controlul traficului de frontieră.

(4) Programul de lucru al punctului de trecere a frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.

(5) Pentru personalul de serviciu maghiar, teritoriul de functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră, existent pe teritoriul României, se extinde asupra:

a) încăperilor de serviciu desemnate, încăperilor comune;

b) drumului public care duce de la frontiera de stat la locul de serviciu;

c) benzilor de circulatie de control;

d) parcării de serviciu.

(6) Pentru personalul de serviciu român, teritoriul de functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră, existent pe teritoriul Republicii Ungare, se extinde asupra:

a) încăperilor de serviciu desemnate, încăperilor comune;

b) drumului public care duce de la frontiera de stat la locul de serviciu;

c) benzilor de circulatie ds control;

d) parcării de serviciu.

 

ARTICOLUL 9

Bors (Bors) – Ârtând

 

(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru traficul international de persoane si de mărfuri.

(2) Controlul traficului de persoane care ies. de pe teritoriul Republicii Ungare si intră pe teritoriul României prin punctul de trecere rutier de la Bors (Bors) - Artând are loc pe teritoriul României, într-un loc comun. În acest scop pe teritoriul României se înfiintează un loc de serviciu maghiar pentru controlul traficului de frontieră.

(3) Controlul traficului international de persoane care ies de pe teritoriul României si intră pe teritoriul Republicii Ungare are loc pe teritoriul Republicii Ungare, într-un loc comun. In acest scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român pentru controlul traficului de frontieră.

(4) Controlul persoanelor participante la traficul international de mărfuri la punctul de trecere a frontierei indicat la alin. (1) are loc într-un loc comun de pe teritoriul Republicii Ungare. În acest scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român pentru controlul traficului de frontieră.

(5) Programul de lucru al punctului de trecere a frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.

(6) Pentru personalul de serviciu maghiar, teritoriul de functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră, existent pe teritoriul României, se extinde asupra:

a) încăperilor de serviciu desemnate, încăperilor comune;

b) drumului public care duce de la frontiera de stat la locul de serviciu;

c) benzilor de circulatie de control;

d) parcării de serviciu.

(7) Pentru personalul de serviciu român, teritoriul de functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră, existent pe teritoriul Republicii Ungare, se extinde asupra:

a) încăperilor de serviciu desemnate, încăperilor comune;

b) drumului public care duce de la frontiera de stat la locul de serviciu;

c) benzilor de circulatie de control si cabinelor de serviciu aferente acestora, atât pe terminalul de iesire, cât si de intrare;

d) parcării de serviciu.

 

ARTICOLUL 10

Valea lui Minai (Érmihályfalva) – Nyirábrány

 

(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru traficul international de persoane.

(2) Controlul traficului international de persoane la punctul de trecere a frontierei rutier Valea lui Mihai (Érmihályfalva) - Nyirábrány are loc pe teritoriul Republicii Ungare, într-un loc comun. În acest scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român pentru controlul traficului de frontieră.

(3) în cazul creării conditiilor necesare de personal, tehnice si de infrastructură, părtile contractante autorizează traficul international de mărfuri la punctul de trecere a frontierei, până la limita unei greutăti totale de 3,5 tone, despre a cărui introducere se va conveni pe cale diplomatică.

(4) Programul de lucru al punctului de trecere a frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.

(5) Pentru personalul de serviciu român, teritoriul de functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră se extinde asupra:

a) încăperilor de serviciu desemnate, încăperilor comune;

b) drumului public care duce de la frontiera de stat la locul de serviciu;

c) benzilor de circulatie de control;

d) parcării de serviciu.

 

ARTICOLUL 11

Urziceni (Csânalos) – Vâllaj

 

(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru traficul international de persoane.

(2) Controlul traficului international de persoane la punctul de trecere a frontierei rutier Urziceni (Csánalos) - Vállaj are loc pe teritoriul Republicii Ungare, într-un loc comun. În acest scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român pentru controlul traficului de frontieră.

(3) In cazul creării conditiilor necesare de personal, tehnice si de infrastructură, părtile contractante autorizează traficul international de mărfuri la punctul de trecere a frontierei, până la limita unei greutăti totale de 3,5 tone, despre a cărui introducere se va conveni pe cale diplomatică.

(4) Programul de lucru al punctului de trecere a frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.

(5) Pentru personalul de serviciu român, teritoriul de functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră se extinde asupra:

a) încăperilor de serviciu desemnate, încăperilor comune;

b) drumului public care duce de la frontiera de stat la locul de serviciu;

c) benzilor de circulatie de control;

d) parcării de serviciu.

 

ARTICOLUL 12

Petea (Pete) – Csengersima

 

(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru traficul international de persoane si de mărfuri.

(2) Controlul traficului de persoane care ies de pe teritoriul Republicii Ungare si intră pe teritoriul României prin punctul de trecere rutier Petea (Pete) - Csengersima are loc pe teritoriul României, într-un loc comun. În acest scop pe teritoriul României se înfiintează un loc de serviciu maghiar pentru controlul traficului de frontieră.

(3) Controlul traficului international de persoane care ies de pe teritoriul României si intră pe teritoriul Republicii Ungare are loc pe teritoriul Republicii Ungare, într-un loc comun. In acest scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român pentru controlul traficului de frontieră.

(4) Controlul persoanelor participante la traficul international de mărfuri la punctul de trecere a frontierei indicat la alin. (1) are loc într-un loc comun de pe teritoriul Republicii Ungare. În acest scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român pentru controlul traficului de frontieră.

(5) Programul de lucru al punctului de trecere a frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.

(6) Pentru personalul de serviciu maghiar, teritoriul de functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră, existent pe teritoriul României, se extinde asupra:

a) încăperilor de serviciu desemnate, încăperilor comune;

b) drumului public care duce de la frontiera de stat la locul de serviciu;

c) benzilor de circulatie de control;

d) parcării de serviciu.

(7) Pentru personalul de serviciu român, teritoriul de functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră, existent pe teritoriul Republicii Ungare, se extinde asupra:

a) încăperilor de serviciu desemnate, încăperilor comune;

b) drumului public care duce de la frontiera de stat la locul de serviciu;

c) benzilor de circulatie de control si cabinelor de serviciu aferente acestora, atât pe terminalul de iesire, cât si de intrare;

d) parcării de serviciu.

 

ARTICOLUL 13

Săcuieni (Székelyhfd) – Létavértes

 

(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru traficul international de persoane, cu exceptia traficului de autobuze, precum si pentru traficul international de mărfuri, până la limita de greutate totală de 7,5 tone.

(2) Controlul traficului international de persoane la punctul de trecere a frontierei rutier Săcuieni (Székelyhîd) - Létavértes are loc pe teritoriul Republicii Ungare, într-un loc comun. În acest scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român pentru controlul traficului de frontieră.

(3) Programul de lucru al punctului de trecere a frontierei este zilnic de la ora 6,00 la ora 22,00, ora locală.

(4) Pentru personalul de serviciu român, teritoriul de functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră se extinde asupra:

a) încăperilor de serviciu desemnate, încăperilor comune;

b) drumului public care duce de la frontiera de stat la locul de serviciu;

c) unei benzi de circulatie de control pe fiecare sens si cabinelor de serviciu;

d) parcării de serviciu.

(5) în cazul creării conditiilor de infrastructură necesare, părtile contractante autorizează traficul de autobuze, asupra căruia se informează reciproc pe cale diplomatică.

 

ARTICOLUL 14

 

În privinta art. 4-13 si 20, încăperile de serviciu necesare în statul da teritoriu personalului de serviciu al statului vecin sunt asigurate de statul de teritoriu, iar asupra utilizării si conditiilor de exploatare a acestora organele competente ale părtilor contractante vor conveni cu administratorul în cadrul unui contract de drept civil.

 

CAPITOLUL III

Puncte de trecere a frontierei feroviare

 

ARTICOLUL 15

Curtici (Kiirtos) – Lökösháza

 

(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru traficul international de persoane si de mărfuri.

(2) Programul de lucru al punctului de trecere a frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.

 

ARTICOLUL 16

Salonta (Nagyszalonta) – Kötegyán

 

(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru traficul international de persoane si de mărfuri.

(2) Programul de lucru al punctului de trecere a frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.

 

ARTICOLUL 17

Episcopia Bihorului (Biharpuspoki) – Biharkeresztes

 

(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru traficul international de persoane si de mărfuri.

(2) Programul de lucru al punctului de trecere a frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.

 

ARTICOLUL 18

Valea lui Minai (Ermihâlyfalva) – Nyirábrány

 

(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru traficul international de persoane si de mărfuri.

(2) Programul de lucru al punctului de trecere a frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.

 

ARTICOLUL 19

Carei (Nagykároly) - Tiborszállás/Ágerdömajor

 

(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru traficul international de persoane si de mărfuri.

(2) Programul de lucru al punctului de trecere a frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.

 

CAPITOLUL IV

Punctul comun de contact

 

ARTICOLUL 20

 

(1) În scopul dezvoltării colaborării internationale si schimbului de informatii dintre organele de politie, la punctul de trecere a frontierei Bors-Ártánd, părtile contractante mentin în functionare, pe teritoriul Republicii Ungare, un punct comun de contact, cu un program zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.

(2) Pentru persoanele de serviciu desemnate de autoritatea competentă română, teritoriul de functionare la punctul comun de contact se extinde asupra:

- drumului de la frontiera de stat comună la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră, în scopul deplasării la serviciu;

- încăperilor de serviciu desemnate la punctul de trecere a frontierei, precum si încăperilor grupurilor sociale aferente acestora;

- parcării de serviciu desemnate.

(3) Părtile contractante asigură conditiile pentru persoanele de serviciu, necesare functionării punctului comun de contact. Persoanele desemnate să-si îndeplinească serviciul la punctul comun de contact trebuie să cunoască bine-în scris si verbal - limba oficială a statului vecin.

 

ARTICOLUL 21

 

În punctul comun de contact, partea contractantă maghiară asigură încăperile de serviciu, permitând totodată părtii contractante române exploatarea echipamentelor de telecomunicatii si operare a datelor instalate de aceasta si realizarea racordurilor necesare la reteaua corespunzătoare a părtii contractante române, având în vedere cele prevăzute la art. 27 din Conventie.

 

ARTICOLUL 22

 

(1) În scopul facilitării colaborării si schimbului de informatii dintre organele de control al traficului de frontieră si cele de combatere a infractionalitătii, părtile contractante pot înfiinta noi puncte comune de contact. Despre aceasta, precum si despre sarcinile locurilor de serviciu comune deja functionale si lărgirea sferei de atributii a organelor care colaborează se va conveni pe calea schimbului de note diplomatice în scopul aplicării prezentului acord.

(2) Functionarii care îsi îndeplinesc serviciul în punctul comun de contact îsi desfăsoară activitatea pe baza prevederilor cuprinse în prezentul acord si a legislatiei interne în vigoare. Functionarii pot primi dispozitii exclusiv de la sefii lor ierarhici.

(3) Structura organizatorică si regulile de functionare de detaliu ale punctului comun de contact sunt cuprinse în regulamentul de organizare si functionare, aprobat de autoritătile competente ale părtilor contractante.

 

ARTICOLUL 23

 

(1) În punctele comune de contact persoanele de serviciu desemnate de autoritătile competente ale părtilor contractante colaborează în concordantă cu legislatia lor internă în vigoare:

a) în schimbul de informatii care interesează controlul traficului de frontieră, analiza acestora, simplificarea, fluidizarea si armonizarea traficului de frontieră;

b) pentru desfăsurarea unui schimb direct de informatii în vederea prevenirii, descoperirii si împiedicării delictelor de trecere a frontierei;

c) în coordonarea interventiilor împotriva imigratiei ilegale si actiunilor ilegale conexe;

d) la cerere, oferă sprijin în vederea solutionării problemelor apărute în cursul aplicării acordului de readmisie în vigoare încheiat între părtile contractante.

(2) În scopul realizării colaborării stabilite la alin. (1), precum si la art. 22 alin. (1), persoanele de serviciu, în conformitate cu sarcinile si competentele lor, desfăsoară un schimb permanent si direct de informatii, îndeosebi în următoarele domenii:

- descoperirea delictelor legate de trecerea frontierei sau săvârsite în apropierea frontierei si a altor fapte ilegale, analiza si evaluarea comportamentelor ilegale tipice si a noilor metode de săvârsire;

- experienta generală acumulată în cursul controalelor traficului de frontieră si tendintele care se pot stabili pe baza acesteia;

- experienta activitătii în cadrul punctului comun de contact;

- evenimente probabile mai importante, cu impact asupra traficului de frontieră (de exemplu, obstacole mai mari de circulatie), manifestări deosebite, cresterea intensă, de durată, a traficului de persoane, măsurile speciale care influentează traficul de frontieră;

- legislatia internă ce interesează obiectul prezentului acord, precum si modificările acesteia.

(3) Părtile contractante:

a) în scopul mentinerii unei legături permanente:

- desemnează persoanele de serviciu responsabile cu mentinerea legăturii;

- trimit experti si fac schimb de experientă în scopul dezvoltării colaborării reglementate prin prezentul acord;

b) în domeniul pregătirii si perfectionării:

- efectuează schimb de experientă asupra metodelor de control si supraveghere a traficului de frontieră;

- oferă sprijin în pregătirea profesională si privind limbile străine a personalului de serviciu al celeilalte părti contractante;

- sprijină perfectionarea specialistilor lor în cadrul unor manifestări, întâlniri de lucru, programe de perfectionare comune.

 

ARTICOLUL 24

 

(1) Persoanele de serviciu, precum si reprezentantii desemnati ai organelor pentru combaterea infractionalitătii (denumiti în continuare functionari) ai părtilor contractante îsi desfăsoară activitatea în locul comun si răspund în cel mai scurt timp posibil la solicitarea functionarului celeilalte părti contractante.

(2) Referitor la modul de rezolvare a solicitărilor, în ceea ce priveste protectia datelor personale si a informatiilor furnizate, vor fi aplicate prevederile Acordului dintre Guvernul României si Guvernul Republicii Ungare privind readmisia cetătenilor proprii si a altor persoane, semnat la Bucuresti la 10 decembrie 2001, iar în privinta protectiei datelor personale si a informatiilor de natură penală, vor fi aplicate prevederile Acordului dintre Guvernul României si Guvernul Republicii Ungare de cooperare în domeniul combaterii crimei organizate, terorismului si a traficului ilicit de droguri, semnat la Budapesta la 19 februarie 1997.

 

 

 

(3) În sensul prezentului acord, autorităti competente pentru combaterea infractionalitătii sunt cele autorizate să ducă la îndeplinire sarcini de prevenire si combatere a infractionalitătii, conform normelor de drept interne ale părtilor contractante:

- din partea României: Politia de Frontieră Română;

- din partea Republicii Ungare: Grănicerii Republicii Ungare, Garda Financiară si Vamală.

 

CAPITOLUL V

Dispozitii finale

 

ARTICOLUL 25

 

(1) Părtile contractante asigură protectia bazelor de date comunitare si unionale accesibile doar uneia dintre părtile contractante. Partea contractantă căreia nu i se permite accesul dă posibilitate celeilalte părti contractante să utilizeze liniile protejate si să aplice regulile de sigurantă pe teritoriul propriului stat.

(2) Diferendele rezultate din interpretarea sau aplicarea prezentului acord vor fi solutionate de părtile contractante în cadrul Comisiei mixte româno-ungare de trafic de frontieră, pe calea negocierilor, iar în caz de nereusită, pe cale diplomatică.

(3) Aplicarea prezentului acord poate fi suspendată temporar, în totalitate sau partial, de oricare parte contractantă, pentru executarea obligatiilor asumate în acordurile internationale si a altor obligatii juridice internationale, precum si din motive de ordine publică, de sigurantă publică ori de sănătate publică. Asupra introducerii sau revocării unei asemenea măsuri cealaltă parte contractantă trebuie informată fără întârziere, pe cale diplomatică. Suspendarea, respectiv încetarea suspendării, în situatiile care reclamă măsuri imediate, produce efecte începând cu primirea notei verbale, iar în celelalte cazuri produce efecte în a 15-a (cincisprezecea) zi după primirea notei verbale.

 

ARTICOLUL 26

 

(1) Prezentul acord se încheie pentru o perioadă nedeterminată. Prezentul acord trebuie aprobat în conformitate cu legislatia internă a statelor părtilor contractante si asupra aprobării părtile contractante se înstiintează reciproc pe cale diplomatică.

(2) Prezentul acord intră în vigoare în cea de-a 15-a zi de la data primirii ultimei note diplomatice prin care se comunică aprobarea, acordul aplicându-se provizoriu începând cu data aderării României la Uniunea Europeană, 1 ianuarie 2007.

(3) Începând cu ziua intrării în vigoare a prezentului acord îsi încetează valabilitatea Acordul dintre Guvernul României si Guvernul Republicii Ungare privind aplicarea Conventiei dintre România si Republica Ungară privind controlul traficului de frontieră rutier si feroviar, semnat la Bucuresti la 27 aprilie 2004.

(4) Prezentul acord poate fi denuntat în scris de oricare dintre părtile contractante, pe cale diplomatică. Prezentul acord îsi încetează valabilitatea în a 30-a (treizecea) zi de la primirea comunicării privind denuntarea.

(5) În cazul suspendării aplicării Conventiei, se suspendă si aplicarea prezentului acord.

(6) În cazul încetării valabilitătii Conventiei, îsi μlerde valabilitatea si prezentul acord.

Semnat la Bucuresti la 21 decembrie 2006, în două exemplare originale, în limbile română si maghiară, toate textele fiind egal autentice.

 

Pentru Guvernul României,

Vasile Blaga,

ministrul administratiei si internelor

Pentru Guvernul Republicii Ungare,

dr. Janos Terenyi,

ambasador extraordinar si plenipotentiar al Republicii Ungare la Bucuresti

 

GUVERNUL ROMÂNIEI

 

HOTĂRÂRE

privind reglementarea actiunilor specifice aferente finantării asistentei din cadrul politicii nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare

 

În temeiul arL 108 din Constitutia României, republicată, si al art. 3 alin. (2) din Legea nr. 404/2006 privind finantarea asistentei pentru dezvoltare din cadrul politicii nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare,

 

Guvernul României adoptă prezenta hotărâre.

 

CAPITOLUL I

Dispozitii generale

 

Art. 1. - (1) Prezenta hotărâre reglementează actiunile specifice aferente finantării asistentei din cadrul politicii nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare.

(2) Prezenta hotărâre stabileste:

a) formele de asistentă pentru dezvoltare acordate de România în cadrul politicii nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare;

b) procedurile de programare si acordare a asistentei pentru dezvoltare;

c) cadrul institutional al gestionării resurselor aferente implementării asistentei pentru dezvoltare.

Art. 2. - (1) Prioritătile geografice si sectoriale ale asistentei pentru dezvoltare sunt cele prevăzute de Strategia natională privind politica de cooperare internatională pentru dezvoltare, aprobată prin Hotărârea Guvernului nr. 703/2006.

(2) Statele partenere beneficiare de asistenta pentru dezvoltare, precum si fondurile financiare alocate în acest scop începând cu anul 2008 se stabilesc de Ministerul Afacerilor Externe si sunt aprobate pe bază de memorandum de Guvernul României, în conformitate cu angajamentele asumate de România pe plan international în materie de finantare si eficacitate a asistentei pentru dezvoltare, cu exceptia asistentei financiare acordate sub forma reducerii/stergerii datoriilor tărilor debitoare României, care intră sub incidenta Legii nr. 29/1994 privind autorizarea Guvernului de a aproba negocierea în vederea recuperării creantelor României provenite din activitatea de comert exterior si cooperare economică internatională, derulată înainte de 31 decembrie 1989, cu modificările ulterioare, si a Ordonantei Guvernului nr. 59/1994 privind reglementarea operatiunilor de import-export care se derulează prin cliring, barter si cooperare economică internatională în baza acordurilor comerciale si de plăti guvernamentale, republicată.

Art. 3. - în sensul prezentei hotărâri, termenii si expresiile mentionate mai jos au următoarea semnificatie:

a) asistentă pentru dezvoltare - suma resurselor alocate de România statelor partenere în conformitate cu criteriile de clasificare a asistentei oficiale pentru dezvoltare elaborate de Comitetul Asistentă pentru Dezvoltare din cadrul Organizatiei pentru Cooperare si Dezvoltare Economică (denumită în continuare OCDE);

b) obiectivele de dezvoltare ale mileniului - cele 8 obiective adoptate cu ocazia Summitului Mileniului, găzduit în septembrie 2000 de Organizatia Natiunilor Unite, de realizat până în 2015, cu tintele si indicatorii aferenti, după cum urmează: eradicarea sărăciei extreme si a foametei; realizarea educatiei primare universale; promovarea egalitătii sanselor si împuternicirea femeilor; reducerea mortalitătii infantile; îmbunătătirea sănătătii materne; combaterea HIV/SIDA, a malariei si a altor boli infectioase; asigurarea durabilitătii mediului înconjurător; dezvoltarea unui parteneriat global pentru dezvoltare;

c) stat partener - statul tert în curs de dezvoltare, cu venit mic sau mediu, căruia România îi acordă asistentă pentru dezvoltare si care este catalogat la data acordării asistentei drept potential beneficiar de asistentă oficială pentru dezvoltare de către Comitetul Asistentă pentru Dezvoltare din cadrul OCDE;

d) stat partener prioritar - stat partener căruia România îi acordă asistentă pentru dezvoltare pe o bază multianuală si pentru care volumul de asistentă pentru dezvoltare oferită depăseste valoarea în lei a sumei de 5 milioane de euro anual, calculată la cursul Băncii Nationale a României la data planificării bugetare a asistentei;

e) ster partener in atentie - stat partener căruia România îi acordă asistentă pentru dezvoltare pentru un proiect specific si/sau anuală si pentru care volumul de asistentă pentru dezvoltare oferită excedează valoarea în lei a sumei de 1 milion de euro, dar nu depăseste valoarea în lei a sumei de 5 milioane de euro anual, sume calculate la cursul Băncii Nationale a României la data planificării bugetare a asistentei;

f) stat donator- stat care acordă asistentă pentru dezvoltare;

g) ajutorul bugetar direct - transferul de fonduri direct la bugetul unui stat partener, realizat în vederea sustinerii unui program guvernamental urmărind cresterea economică, reducerea sărăciei, ajustarea fiscală, întărirea institutională, precum si a proceselor bugetare, acestea fiind cheltuite conform sistemelor de gestiune financiară ale statului partener;

h) proiecte de asistentă pentru dezvoltare - setul de activităti interconectate, vizând realizarea unui obiectiv punctual de dezvoltare;

i) programe de asistentă pentru dezvoltare - setul de activităti si proiecte de asistentă pentru dezvoltare, interconectate, urmărind consolidarea unui sector specific de interes al statului partener;

j) înfrătire institutională - setul de activităti destinate întăririi capacitătii administrative si judiciare a statelor partenere realizate în colaborare cu institutiile publice românesti.

 

CAPITOLUL II

Forme de asistentă pentru dezvoltare

 

Art. 4. - Guvernul României utilizează următoarele modalităti de distributie a asistentei pentru dezvoltare:

a) asistentă bilaterală - include activitătile de cooperare pentru dezvoltare derulate direct între România si statul partener ori indirect, prin intermediul unor contractanti;

b) asistentă trilaterală - include asistentă pentru dezvoltare prin cofinantare acordată de România statului partener în cooperare cu alt stat donator si/sau o organizatie internatională;

c) asistentă multilaterală - include contributii către organizatiile internationale care îsi derulează activitatea, partial sau integral, în aria cooperării pentru dezvoltare si aflate pe lista Comitetului Asistentă pentru Dezvoltare al OCDE, precum si către fondurile special administrate de acestea, în acest scop.

Art. 5. - Guvernul României acordă următoarele tipuri de asistentă pentru dezvoltare:

a) asistentă tehnică, prin furnizarea de servicii, produse si lucrări în vederea sustinerii procesului de dezvoltare a statului partener - inclusiv pregătirea si formarea profesională, furnizarea rezultatelor unor activităti de cercetare, burse de studii si stagii de practică, implementarea de proiecte de înfrătire institutională si alte initiative de recrutare, formare si plasare de voluntari;

b) asistentă financiară - asistenta financiară nerambursabilă si stergerea si/sau reducerea datoriilor tărilor în curs de dezvoltare fată de România;

c) asistentă umanitară - asistenta de urgentă acordată statelor în caz de dezastre si conflicte armate prelungite, cu scopul atenuării consecintelor asupra victimelor, inclusiv asistenta oferită în procesul de tranzitie de la o situatie de criză umanitară către procesele de reabilitare sau reconstructie timpurie;

d) asistentă pentru educatie pentru dezvoltare si activitătile de constientizare publică în domeniul dezvoltării - activitătile desfăsurate în scopul promovării unei mai bune întelegeri în rândul populatiei sau al unor categorii specifice ale populatiei, a problemelor cu care se confruntă statele în curs de dezvoltare, a necesitătii solidarizării cu acestea, ce contribuie la crearea unui sprijin puternic, din partea opiniei publice, în favoarea politicii nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare.

 

CAPITOLUL III

Cadrul de programare a asistentei pentru dezvoltare

 

Art. 6. - (1) Ministerul Afacerilor Externe elaborează o strategie de tară pentru fiecare stat partener prioritar.

(2) Strategia de tară reprezintă documentul-cadru de programare întocmit prin consultări cu Guvernul statului partener prioritar, autoritătile competente române si societatea civilă.

(3) Strategia de tară se adoptă de către Guvernul României prin memorandum elaborat si înaintat spre aprobare de către Ministerul Afacerilor Externe.

(4) Strategia de tară contine următoarele elemente:

a) descrierea obiectivelor politicii României în materie de cooperare pentru dezvoltare;

b) descrierea obiectivelor statului partener prioritar în materie de reducere a sărăciei si dezvoltare;

c) analiza situatiei politice, economice si sociale din statul partener prioritar;

d) descrierea activitătilor trecute si prezente ale principalilor donatori;

e) strategia de răspuns a României la problemele de dezvoltare ale statului partener prioritar, prin identificarea unui număr limitat de sectoare de interventie;

f) obiectivele globale ale cooperării pentru perioada de aplicabilitate a Strategiei de tară;

g) alocarea resurselor financiare pentru fiecare sector de interventie;

h) obiectivele specifice, rezultatele asteptate si indicatorii de performantă pentru fiecare sector de interventie;

i) modalitătile de integrare a tematicilor orizontale, cu aplicabilitate în mai multe sectoare de interventie;

j) programele avute în vedere pentru atingerea obiectivelor, precum si tipurile si instrumentele de asistentă.

(5) Strategia de tară se aprobă pentru un interval de minimum 3 ani, în functie de ciclul bugetar al statului partener si de strategiile acestuia de dezvoltare si reducere a sărăciei.

(6) Strategia de tară se revizuieste periodic, pe baza evaluărilor rezultatelor obtinute.

Art. 7. - (1) Guvernul României, la propunerea Ministerului Afacerilor Externe, încheie acorduri de cooperare pentru dezvoltare cu fiecare stat partener prioritar. Acordurile de cooperare pentru dezvoltare sunt initiate si negociate de Ministerul Afacerilor Externe în colaborare cu autoritătile publice din România, cu atributii în domeniile prevăzute la art. 2 din Legea nr. 404/2006 privind finantarea asistentei pentru

dezvoltare din cadrul politicii nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare.

(2) Acordurile de cooperare pentru dezvoltare reprezintă instrumentul juridic de reglementare a asistentei pentru dezvoltare acordate de Guvernul României.

(3) Acordurile de cooperare pentru dezvoltare stabilesc termenii si conditiile generale de acordare de asistentă pentru dezvoltare, inclusiv domeniile de interventie, alocările financiare indicative, precum si drepturile si obligatiile părtilor.

(4) Acordurile de cooperare pentru dezvoltare au caracter de contract de stat si nu intră sub incidenta Legii nr. 590/2003 privind tratatele.

Art. 8. - (1) Ministerul Afacerilor Externe încheie memorandumuri de întelegere cu toate statele partenere, cu exceptia statelor debitoare României care beneficiază de asistenta financiară pentru dezvoltare acordată sub forma reducerii/stergerii datoriilor care intră sub incidenta Legii nr. 29/1994, cu modificările ulterioare, si a Ordonantei Guvernului nr. 59/1994, republicată.

(2) Pentru statele partenere prioritare memorandumurile de întelegere au la bază acordurile de cooperare pentru dezvoltare si stabilesc elementele specifice de asistentă (sprijin bugetar, proiecte, programe) agreate între cele două părti.

(3) Pentru statele partenere în atentie si celelalte state partenere memorandumurile de întelegere stabilesc atât cadrul general de cooperare, cât si elementele specifice de asistentă (sprijin bugetar, proiecte, programe) agreate între cele două părti.

Art. 9. - (1) Ministerul Afacerilor Externe elaborează Planul anual de actiune care cuprinde:

a) descrierea activitătilor planificate pentru următoarele 12 luni;

b) calendarul activitătilor si îndeplinirii obiectivelor;

c) bugetul pentru anul fiscal aferent.

(2) Planul anual de actiune fundamentează memorandumurile de întelegere si este aprobat prin ordin al ministrului afacerilor externe, la propunerea secretarului de stat responsabil pentru politica natională de cooperare internatională pentru dezvoltare din cadrul Ministerului Afacerilor Externe.

Art. 10. - (1) Ministerul Afacerilor Externe elaborează o strategie multianuală pentru acordarea de asistentă pentru dezvoltare în plan multilateral.

(2) Strategia prevăzută la alin. (1) contine următoarele elemente:

a) descrierea obiectivelor politicii României în materie de cooperare pentru dezvoltare;

b) analiza globală a activitătilor tematice si geografice desfăsurate de organizatiile internationale în materie de dezvoltare;

c) strategia de cooperare multilaterală pentru dezvoltare a României prin identificarea unor priorităti de actiune;

d) alocarea resurselor financiare între priorităti.

(3) Strategia pentru asistentă multilaterală se aprobă pentru un interval de minimum 3 ani, în functie de calendarul atingerii obiectivelor de dezvoltare ale mileniului.

(4) Strategia pentru asistentă multilaterală se adoptă de Guvernul României, prin memorandumul elaborat si înaintat spre aprobare de Ministerul Afacerilor Externe.

 

CAPITOLUL IV

Proceduri de acordare a asistentei pentru dezvoltare

 

Art. 11. - Achizitiile de produse, servicii si lucrări finantate în cadrul politicii nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare se realizează potrivit prevederilor legale române în materie de achizitii publice.

Art. 12. - (1) Ministerul Afacerilor Externe cofinantează proiecte si programe de asistentă pentru dezvoltare atunci când acestea sunt în concordantă cu Strategia de tară în cazul statelor partenere prioritare sau dacă aceste proiecte si programe fac obiectul unui memorandum de întelegere specific încheiat între toate statele donatoare cofinantatoare si statul partener.

(2) Memorandumul de întelegere specific stabileste drepturile si obligatiile părtilor, legislatia aplicabilă pentru atribuirea contractelor de achizitie publică si metodologia, termenii si conditiile de efectuare a plătilor.

Art. 13. - Ministerul Afacerilor Externe contribuie la finantarea de proiecte si programe de asistentă pentru dezvoltare implementate de organizatii multilaterale, inclusiv fondurile administrate de acestea, în sprijinirea dezvoltării statelor partenere, cu respectarea prioritătilor stabilite prin strategiile de tară, în cazul în care există, sau pe baza memorandumurilor de fntelegere încheiate cu fiecare stat partener.

Art. 14. - Ministerul Afacerilor Externe contribuie la finantarea bugetului organizatiilor internationale, inclusiv fondurile administrate de acestea, în baza strategiei multianuale pentru asistentă multilaterală.

Art. 15. - Finantarea contributiilor prevăzute la art. 13 si 14 se realizează în baza unui memorandum de întelegere încheiat între Ministerul Afacerilor Externe si organizatia internatională în cauză sau conform procedurilor legale aplicabile organizatiei internationale respective.

Art. 16. - (1) Organizatiile neguvernamentale din România pot beneficia de finantare nerambursabilă din bugetul Ministerului Afacerilor Externe destinat finantării asistentei pentru dezvoltare pentru:

a) derularea de programe si proiecte de cooperare pentru dezvoltare în statele partenere; si

b) derularea de activităti de educatie pentru dezvoltare si constientizare publică în domeniul dezvoltării.

(2) Finantarea activitătilor organizatiilor neguvernamentale din România se realizează în baza Legii nr. 350/2005 privind regimul finantărilor nerambursabile din fonduri publice alocate pentru activităti nonprofit de interes general.

Art. 17. - (1) Ajutorul bugetar direct, la nivel general si/sau sectorial, se acordă statului partener care îndeplineste cumulativ următoarele conditii:

a) demonstrează un angajament credibil în vederea reducerii sărăciei si a cresterii economice, angajament reflectat prin existenta unei strategii de reducere a sărăciei sau a unui document echivalent acesteia;

b) există un sistem stabil de gestiune macroeconomică si un mediu propice dezvoltării sectorului privat;

c) calitatea gestionării finantelor publice este adecvată si/sau există un program credibil de reformă a sistemului de gestionare a finantelor publice;

d) există un cadru sectorial de cheltuieli pe termen mediu si un buget anual;

e) se realizează coordonarea sectorială între donatori sub conducerea Grupului Băncii Mondiale sau a Comisiei Europene cu participarea activă a Guvernului tării partenere;

f) există un set de indicatori de performantă pentru evaluarea progresului în realizarea obiectivelor politicilor nationale.

(2) Ajutorul bugetar direct se acordă prin memorandumurile de întelegere prevăzute la art. 8, încheiate de Ministerul Afacerilor Externe cu fiecare stat partener.

Art. 18. - (1) Ministerul Afacerilor Externe cofinantează din bugetul destinat finantării asistentei pentru dezvoltare proiecte de înfrătire institutională cu statele partenere în domenii în care experienta României este relevantă si de interes pentru acestea.

(2) Proiectele de înfrătire institutională prevăzute la alin. (1) îndeplinesc cumulativ următoarele conditii:

a) se încadrează în prioritătile stabilite în Strategia de tară sau memorandumul de întelegere aferente tărilor partenere;

b) se desfăsoară pe baza unor termeni de referintă clari care specifică obiectivele proiectului, activitătile avute în vedere, obligatiile statului partener si rezultatele asteptate;

c) fac obiectul unui acord între Ministerul Afacerilor Externe si institutia publică română în cauză prin care sunt stabiliti termenii sl conditiile proiectului de înfrătire institutională;

d) se desfăsoară pe o perioadă cuprinsă între 30 de zile si 36 de luni.

(3) Proiectele de înfrătire institutională se aprobă prin memorandumurile de întelegere prevăzute la art. 8, încheiate de Ministerul Afacerilor Externe cu fiecare stat partener.

Art. 19. - Furnizarea de asistentă umanitară este un act de vointă unilaterală a Guvernului României si este acordată direct statului în cauză ori indirect, prin intermediul unei organizatii internationale cu competente în domeniu sau al unui fond autonom gestionat de o organizatie internatională de profil ori al unui fond constituit în mod special pentru a răspunde necesitătilor unei crize umanitare sau al unor organizatii neguvernamentale române si/sau străine.

Art. 20. - Pentru acordarea de asistentă umanitară prin intermediul organizatiilor neguvernamentale, române sau străine, este necesar ca acestea să îndeplinească următoarele criterii:

a) să aibă experientă în domeniul asistentei umanitare;

b) să cunoască circumstantele si specificul local;

c) să facă dovada detinerii mijloacelor de furnizare rapidă si eficientă a asistentei umanitare către persoanele sinistrate.

Art. 21. - (1) Ministerul Afacerilor Externe înaintează, prin memorandum, spre aprobare Guvernului României propunerile de finantare de asistentă umanitară.

(2) Ministerul Afacerilor Externe asigură finantarea asistentei umanitare din bugetul destinat asistentei pentru dezvoltare prin ordin al ministrului afacerilor externe.

Art. 22. - Actiunile de reducere/stergere a datoriilor statelor în curs de dezvoltare fată de România provenite din activitatea de comert exterior si cooperare economică internatională, derulată înainte de 31 decembrie 1989, precum si â celor evidentiate în conturile de cliring, bartersi cooperare economică internatională, în baza acordurilor comerciale si de plăti guvernamentale, se realizează potrivit prevederilor legale române în vigoare.

 

CAPITOLUL V

Cadrul institutional

 

Art. 23. - Ministerul Afacerilor Externe este coordonatorul politicii nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare.

Art. 24. - Atributiile Ministerului Afacerilor Externe în problematica reglementată prin prezenta hotărâre sunt cele prevăzute de Strategia natională privind politica natională de cooperare internatională pentru dezvoltare.

Art. 25. - Aprobarea proiectelor si programelor de asistentă pentru dezvoltare se realizează prin ordin al ministrului afacerilor externe în baza Strategiei nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare, a prioritătilor geografice si a fondurilor financiare aprobate în acest scop de Guvernul României si cu respectarea prevederilor prezentului act normativ.

Art. 26. - (1) Activitatea privind evaluarea tehnică si financiară a proiectelor si programelor de asistentă pentru dezvoltare se realizează de către Oficiul de Plăti si Contractare PHARE (OPCP) din cadrul Ministerului Economiei si Finantelor.

(2) OPCP asigură:

a) organizarea procedurilor de achizitie publică, a selectiilor publice de proiecte si a licitatiilor;

b) evaluarea si avizarea proiectelor si programelor în vederea aprobării;

c) contractarea proiectelor si programelor;

d) raportarea privind situatia financiară a proiectelor si programelor;

e) evaluarea stadiului îndeplinirii obiectivelor proiectelor si programelor;

f) auditarea conturilor de către autoritătile nationale.

(3) Modalitătile specifice de colaborare între Ministerul Afacerilor Externe si Ministerul Economiei si Finantelor se stabilesc printr-un memorandum de întelegere încheiat între cele două institutii în termen de 30 de zile de la data intrării în vigoare a prezentei hotărâri.

ArL 27. - In termen de 30 de zile de la data intrării în vigoare a prezentei hotărâri, ministrul afacerilor externe si ministrul economiei si finantelor aprobă prin ordin comun manualul de implementare a asistentei pentru dezvoltare.

Art. 28. - (1) în procesul de elaborare, implementare si coordonare a politicii nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare, Ministerul Afacerilor Externe colaborează cu autoritătile administratiei publice din România, cu atributii în domeniile prevăzute la art. 2 din Legea nr. 404/2006.

(2) Institutiile publice române propun Ministerului Afacerilor Externe proiecte si programe de asistentă pentru dezvoltare în vederea finantării acestora din bugetul destinat finantării politicii nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare. Activitătile de implementare a acestor proiecte si programe sunt realizate de institutiile publice române initiatoare.

Art. 29. - (1) La data intrării în vigoare a prezentei hotărâri se înfiintează, în subordinea Consiliului interministerial pentru relatii externe si afaceri europene prevăzut în anexa nr. 2 la Hotărârea Guvernului nr. 750/2005 privind constituirea consiliilor interministeriale permanente, Comisia pentru cooperare economică si dezvoltare internatională, denumită în continuare Comisia.

(2) Comisia prevăzută la alin. (1) este alcătuită din câte un reprezentant, la nivel de secretar de stat/presedinte, din următoarele institutii:

a) Ministerul Educatiei, Cercetării si Tineretului;

b) Ministerul Economiei si Finantelor;

c) Ministerul Mediului si Dezvoltării Durabile;

d) Ministerul Transporturilor;

e) Ministerul Sănătătii Publice;

f) Ministerul pentru întreprinderi Mici si Mijlocii, Comert, Turism si Profesii Liberale;

g) Ministerul Justitiei;

h) Ministerul Culturii si Cultelor; i) Ministerul Internelor si Reformei Administrative; j) Ministerul Comunicatiilor si Tehnologiei Informatiei; k) Ministerul Agriculturii si Dezvoltării Rurale; I) Ministerul Dezvoltării, Lucrărilor Publice si Locuintelor; m) Ministerul Muncii, Familiei si Egalitătii de Sanse; n) Agentia Română pentru Investitii Străine; o) Autoritatea Natională pentru Reglementarea si Monitorizarea Achizitiilor Publice;

p) Agentia pentru Strategii Guvernamentale.

(3) Ministerul Afacerilor Externe este reprezentat în Comisie de secretarul de stat pentru afaceri europene si de seful Departamentului pentru Relatiile cu Românii de Pretutindeni.

(4) Comisia actionează în calitate de:

a) forum de analiză, dezbatere si planificare interinstitutională a problematicilor decurgând din gestionarea relatiei Guvernului României cu OCDE; si

b) forum de analiză, dezbatere si planificare interinstitutională a problematicilor privind realizarea politicii nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare.

(5) Ministerul Afacerilor Externe asigură presedintia si secretariatul Comisiei. Sedintele în plen se convoacă de către Ministerul Afacerilor Externe ori de câte ori este necesar.

(6) Regulamentul de organizare si functionare a Comisiei se elaborează de către Comisie, se aprobă în prima sedintă a acesteia si constituie anexă la Regulamentul privind organizarea si functionarea Consiliului interministerial pentru relatii externe si afaceri europene.^

Art. 30. - (1) în termen de 60 de zile de la data intrării în vigoare a prezentei hotărâri se înfiintează Consiliul pentru cooperare pentru dezvoltare, denumit în continuare Consiliul.

(2) Consiliul prevăzut la alin. (1) este organism fără personalitate juridică, functionează pe lângă Ministerul Afacerilor Externe, are un rol consultativ si asistă Ministerul Afacerilor Externe în definirea si implementarea politicii nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare.

(3) Consiliul este compus din reprezentanti ai Ministerului Afacerilor Externe, invitati ai organizatiilor membre ale Federatiei Organizatiilor Neguvernamentale pentru Dezvoltare din România, precum si invitati din partea Parlamentului României, societătii civile, institutiilor de cult, mediului academic, mediului de afaceri, sindicatelor, mediei si alte persoane fizice sau juridice care îsi desfăsoară activitatea în domeniul asistentei pentru dezvoltare.

(4) Ministerul Afacerilor Externe asigură presedintia si secretariatul Consiliului. Sedintele în plen se convoacă de către Ministerul Afacerilor Externe ori de câte ori este necesar.

(5) Regulamentul de organizare si functionare a Consiliului va fi elaborat de către Ministerul Afacerilor Externe în termen de 60 de zile de la data intrării în vigoare a prezentei hotărâri, urmând a fi supus spre aprobare Consiliului, în prima reuniune a acestuia.

(6) Federatia Organizatiilor Neguvernamentale pentru Dezvoltare este partener al Guvernului României în eforturile de dezvoltare a politicii nationale de cooperare pentru dezvoltare.

 

CAPITOLUL VI

Cadrul financiar

 

Art. 31. - (1) Finantarea actiunilor specifice aferente asistentei pentru dezvoltare se asigură de la bugetul de stat, prin bugetul Ministerului Afacerilor Externe.

(2) Fondurile aferente finantării actiunilor prevăzute la alin. (1) se asigură din bugetul Ministerului Afacerilor Externe de la capitolul „Alte servicii publice generale", subcapitolul „Asistentă natională externă pentru dezvoltare", titlul „Alte transferuri", articolul „Transferuri curente în străinătate", alineatul „Cooperare economică internatională".

(3) Fondurile aprobate potrivit alin. (2) nu se pot redistribui si utiliza la alte subdiviziuni ale clasificatiei bugetare

 

CAPITOLUL VII

Dispozitii finale

 

Art. 32. - Pe data intrării în vigoare a prezentei hotărâri se suplimentează numărul de posturi prevăzut pentru Ministerul Economiei si Finantelor cu un număr de 7 posturi, în vederea îndeplinirii sarcinilor Oficiului de Plăti si Contractare PHARE în cadrul politicii nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare, conform Hotărârii Guvernului nr. 386/2007 privind organizarea si functionarea Ministerului Economiei si Finantelor.

 

PRIM-MINISTRU

CĂLIN POPESCU-TĂRICEANU

Contrasemnează:

Ministrul afacerilor externe,

Adrian Mihai Cioroianu

Ministrul economiei si finantelor,

Varujan Vosganian

 

Bucuresti, 11 iulie 2007.

Nr. 747.

 

ACTE ALE ORGANELOR DE SPECIALITATE ALE ADMINISTRATIEI PUBLICE CENTRALE

 

MINISTERUL AGRICULTURII SI DEZVOLTĂRII RURALE

 

ORDIN

privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi etal.

 

În temeiul prevederilor art. 5 din Ordonanta Guvernului nr. 136/2000 privind măsurile de protectie împotriva introducerii si răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România, aprobată cu modificări prin Legea nr. 214/2001,

văzând Referatul de aprobare nr. 292.478 din 1 iunie 2007 al Agentiei Nationale Fitosanitare din cadrul Ministerului Agriculturii si Dezvoltării Rurale,

în temeiul Hotărârii Guvernului nr. 385/2007 privind organizarea si functionarea Ministerului Agriculturii si Dezvoltării Rurale,

ministrul agriculturii si dezvoltării rurale emite prezentul ordin.

Art. 1. - Prezentul ordin stabileste măsurile care se aplică împotriva bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., cunoscută anterior sub denumirea de Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, denumită în continuare organism, cu privire la plantele-gazdă ale organismului, prevăzute în anexa nr. I sectiunea I, denumite în continuare material de plantare, în scopul:

a) localizării si determinării distributiei;

b) prevenirii aparitiei si răspândirii; si

c) împiedicării răspândirii si controlului în vederea eradicării, dacă a fost semnalată.

Art. 2. - (1) Organismele oficiale responsabile din România, respectiv unitătile fitosanitare judetene si a municipiului Bucuresti, efectuează inspectii oficiale sistematice anuale asupra materialului de plantare originar din raza lor de activitate.

(2) În scopul identificării altor posibile surse de contaminare care amenintă productia materialului de plantare, organismele oficiale responsabile efectuează o evaluare a riscului si, cu exceptia cazului în care în timpul evaluării nu se identifică niciun risc de răspândire a organismului, desfăsoară inspectii în zonele de productie a materialului de plantare pentru detectarea organismului asupra altor plante decât materialul de plantare prevăzut la art. 1, inclusiv asupra plantelor-gazdă solanacee sălbatice, precum si asupra apei de suprafată, asupra deseurilor lichide provenite din procesările industriale sau din locurile de ambalare, manipulare a materialului de plantare, utilizate pentru irigarea sau stropirea materialului de plantare. În functie de riscul identificat se determină extinderea inspectiilor prevăzute la alin. (1).

(3) Organismele oficiale responsabile pot, de asemenea, să desfăsoare inspectii oficiale pentru detectarea organismului pe materiale, cum ar fi mediu de crestere, sol si deseuri solide rezultate din procesările industriale sau locurile de ambalare.

Art. 3. - (1) Inspectiile oficiale prevăzute la art. 2 sunt efectuate:

a) asupra materialului de plantare, în conformitate cu prevederile anexei nr. I sectiunea II pct. 1;

b) asupra plantelor-gazdă, altele decât materialul de plantare prevăzut la art. 1, si asupra apei, inclusiv asupra deseurilor lichide, si, dacă este cazul, sunt prelevate probe si supuse testelor de laborator oficiale sau oficial supravegheate, în conformitate cu metodele corespunzătoare;

c) după caz, asupra altor materiale, în conformitate cu metodele corespunzătoare.

(2) Detaliile suplimentare cu privire la procedurile de inspectie prevăzute la alin. (1), numărul, originea, esalonarea si perioada prelevării probelor sunt elaborate de Laboratorul Central pentru Carantină Fitosanitară si aprobate de Agentia Natională Fitosanitară din cadrul Ministerului Agriculturii si Dezvoltării Rurale, pe baza principiilor stiintifice, statistice si a biologiei organismului, luând în considerare sistemul particular de productie a materialului de plantare si, după caz, al altor plante-gazdă ale organismului.

Art. 4. - (1) Detaliile si rezultatele inspectiilor oficiale prevăzute la art. 2 trebuie notificate anual celorlalte state membre si Comisiei Europene, denumită în continuare Comisie, în conformitate cu prevederile anexei nr. I sectiunea II pct. 2. Aceste notificări sunt prezentate până la 1 iunie, cu exceptia celor referitoare la cartofii de sământă obtinuti din propria exploatatie, pentru care notificarea este prezentată până la 1 septembrie. Detaliile si rezultatele recoltelor se referă la productia anului precedent. Detaliile acestor notificări pot fi prezentate Comitetului Permanent pentru Sănătatea Plantelor, denumit în continuare Comitet.

(2) În conformitate cu procedura stabilită la art. 19 alin. (2) din Hotărârea Guvernului nr. 563/2007 pentru aprobarea Normelor metodologice de aplicare a Ordonantei Guvernului nr. 136/2000 privind măsurile de protectie împotriva introducerii si răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România, pot fi adoptate:

a) metode adecvate pentru inspectiile si testele de laborator prevăzute la art. 3 alin. (1) lit. b);

b) metode adecvate pentru inspectiile prevăzute la art. 3 alin. (1) lit. c);

c) detalii suplimentare ale inspectiilor prevăzute la art. 3 alin. (2) pentru asigurarea unor niveluri comparabile de asigurare între statele membre.

Art. 5. - Organismele oficiale responsabile asigură ca aparitia suspectată sau prezenta confirmată a organismului pe raza lor de activitate să fie comunicată Agentiei Nationale Fitosanitare din cadrul Ministerului Agriculturii si Dezvoltării Rurale.

Art. 6. - În cazul unei aparitii suspectate a organismului, Laboratorul Central pentru Carantină Fitosanitară sau alte laboratoare aprobate de Ministerul Agriculturii si Dezvoltării Rurale efectuează teste de laborator oficiale sau oficial supravegheate, utilizând pentru materialul de plantare metoda corespunzătoare, conform anexei nr. II si în conformitate cu conditiile prevăzute în anexa nr. III pct. 1, sau, în toate celelalte cazuri, orice altă metodă aprobată oficial, în scopul confirmării sau infirmării aparitiei suspectate a organismului. În cazul confirmării prezentei organismului, se aplică prevederile anexei nr. III pct. 2.

Art. 7. - (1) În asteptarea confirmării sau infirmării aparitiei suspectate a organismului conform art. 6, în cazurile de aparitie suspectată în care:

a) s-au constatat simptome de diagnostic cauzate de organism si un rezultat pozitiv prin testul/testele de depistare conform anexei nr. II sectiunea I pct. 1 si sectiunea II a fost identificat; sau

b) a fost identificat un rezultat pozitiv prin testul/testele de depistare conform anexei nr. II sectiunea I pct. 2 si sectiunea III, Ministerul Agriculturii si Dezvoltării Rurale prin unitătile fitosanitare:

1. interzice circulatia plantelor si tuberculilor din toate recoltele, loturile sau transporturile din care au fost prelevate probele, aceasta putându-se face doar sub control oficial si cu conditia să se fi stabilit că nu există niciun risc identificabil de răspândire a organismului;

2. aplică măsurile necesare pentru identificarea originii aparitiei suspectate;

3. introduce măsuri de precautie suplimentare adecvate, bazate pe gradul de risc estimat, în special, în legătură cu productia materialului de plantare si cu circulatia loturilor de cartofi de sământă, altii decât cei prevăzuti la pct. 1, produsi la locul de productie de unde s-au prelevat probele prevăzute la pct. 1, în scopul prevenirii oricărei răspândiri a organismului.

(2) În cazurile aparitiilor suspectate unde există un risc de contaminare a materialului de plantare sau a apei de suprafată din sau într-un alt stat membru (state membre), statul membru pe raza căruia aparitia suspectată a fost înregistrată notifică de îndată, în conformitate cu riscul identificat, detaliile aparitiei suspectate altui stat sau altor state membre implicate si corespunzător cooperării între statele membre mentionate. Statul membru (statele membre) care a (au) notificat introduce (introduc) măsuri de precautie conform alin. (1) pct. 3 si iau măsuri suplimentare corespunzătoare, conform art. 6 si alin. (1) din prezentul articol.

(3) În conformitate cu procedura stabilită în art. 19 alin. (2) din Hotărârea Guvernului nr. 563/2007, sunt adoptate măsurile prevăzute la alin. (1) pct. 3.

Art. 8. - (1) Dacă în urma testelor de laborator oficiale sau oficial supravegheate efectuate pentru materialul de plantare în conformitate cu metoda prevăzută în anexa nr. II sau, în toate celelalte cazuri, cu orice altă metodă aprobată oficial se confirmă prezenta organismului într-o probă prelevată în conformitate cu prezentul ordin, organismele oficiale responsabile, având în vedere principiile stiintifice fundamentate, biologia organismului si productia specifică, comercializarea si sistemele de procesare a plantelor-gazdă ale organismului, dispun măsurile prevăzute la alin. (2), (3) si (4).

(2) În cazul materialului de plantare organismele oficiale responsabile:

a) deschid o investigatie pentru determinarea extinderii si sursei sau surselor primare de contaminare, în conformitate cu prevederile anexei nr. IV, cu testări suplimentare în conformitate cu art. 6, cel putin asupra stocurilor de cartofi de sământă înruditi prin donare; si

b) desemnează ca fiind contaminate materialul de plantare, transportul si/sau lotul din care s-a prelevat proba si utilajele, vehiculul, vasul, depozitul sau părti din acestea si orice alte obiecte, inclusiv materialul de ambalare care a venit în contact cu materialul de plantare din care a fost prelevată proba;

c) desemnează ca fiind contaminate, dacă este cazul, câmpul sau câmpurile, unitatea ori unitătile de productie de culturi protejate si locul sau locurile de productie de unde s-a recoltat materialul de plantare si din care a fost prelevată proba;

d) pentru probele prelevate în perioada de vegetatie desemnează ca fiind contaminate câmpul sau câmpurile, locul ori locurile de productie si, dacă este cazul, unitatea sau unitătile de productie de culturi protejate din care a fost prelevată proba; si

e) determină, în conformitate cu prevederile anexei nr. V pct. 1, extinderea contaminării probabile prin contact înainte sau după recoltare, prin legături de productie, irigare ori stropire sau printr-o înrudire clonală cu materialul desemnat contaminat; si

f) demarchează o zonă pe baza desemnării contaminării în conformitate cu prevederile lit. b), c) si d), a determinării extinderii contaminării probabile în conformitate cu lit. e) si a răspândirii posibile a organismului, în conformitate cu prevederile anexei nr. V pct. 2 (i).

(3) În cazul culturilor de plante-gazdă, altele decât cele prevăzute la alin. (2), la care productia de material de plantare este identificată ca risc, organismele oficiale responsabile:

a) deschid o investigatie în conformitate cu prevederile alin. (2) lit. a); si

b) desemnează ca fiind contaminate plantele-gazdă ale organismului de la care a fost prelevată proba; si

c) determină contaminarea probabilă si demarchează o zonă în conformitate cu alin. (2) lit. e) si, respectiv, lit. f). În legătură cu productia de material de plantare.

(4) în cazul apelor de suprafată, inclusiv al deseurilor lichide provenite din procesările industriale sau din locurile de ambalare a materialului de plantare, si pentru plantele-gazdă solanacee sălbatice asociate, acolo unde productia de material de plantare este identificată ca risc prin irigatie, stropire sau inundare cu apă de suprafată, organismele oficiale responsabile:

a) deschid o investigatie, inclusiv o inspectie în perioade corespunzătoare, pentru probele prelevate din apele de suprafată si, dacă sunt prezente, pentru plantele-gazdă solanacee sălbatice, în vederea stabilirii extinderii contaminării; si

b) desemnează ca fiind contaminată apa de suprafată din care au fost prelevate proba sau probele, corespunzătoare extinderii contaminării si în baza investigatiilor efectuate în conformitate cu lit. a); si

c) determină contaminarea probabilă si demarchează o zonă pe baza desemnării contaminării în conformitate cu lit. b) si a posibilei răspândiri a organismului, tinând seama de prevederile anexei nr. V pct. 1 si pct. 2 (ii).

Art. 9. - (1) Ministerul Agriculturii si Dezvoltării Rurale, prin Agentia Natională Fitosanitară, notifică de îndată altor state membre si Comisiei, în conformitate cu prevederile anexei nr. V pct. 3, orice contaminare stabilită conform art. 8 alin. (2) lit. b), c) si d) si alin. (4) lit. b) si detaliile zonei demarcate conform art. 8 alin. (2) lit. f) si, dacă este cazul, conform art. 8 alin. (4) lit. c). Detaliile notificării efectuate conform prevederilor acestui alineat pot fi prezentate Comitetului.

(2) Ministerul Agriculturii si Dezvoltării Rurale, prin Agentia Natională Fitosanitară, în acelasi timp, va prezenta Comisiei notificări suplimentare conform anexei nr. V pct. 4. Detaliile notificării efectuate conform prevederilor acestui alineat pot fi prezentate Comitetului.

Art. 10. - În urma notificării în conformitate cu prevederile art. 9, celelalte state membre vizate în notificare deschid o investigatie în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. a) si, dacă este cazul, cu art. 8 alin. (4) lit. a) si iau măsuri suplimentare, după caz^în conformitate cu art. 8 si 9.

Art. 11. - Materialul de plantare desemnat ca fiind contaminat conform art. 8 alin. (2) lit. b), c) si d) nu poate fi plantat si de aceea, sub controlul organismelor oficiale responsabile, este supus uneia dintre dispozitiile anexei nr. VI pct. 1, astfel încât să nu existe niciun risc identificabil de răspândire a organismului.

Art. 12. - Materialul de plantare desemnat ca fiind probabil contaminat conform art. 8 alin. (2) lit. e) si alin. (4) lit. c), inclusiv materialul de plantare pentru care a fost identificat un risc, produs în locuri de productie desemnate ca probabil contaminate în conformitate cu prevederile art. 8 alin. (2) lit. e), nu poate fi plantai si, sub controlul organismelor oficiale responsabile, este utilizat sau eliminat în conformitate cu prevederile anexei nr. VI pct. 2, astfel încât să nu existe niciun risc identificabil de răspândire a organismului.

Art. 13. - Orice utilaj, vehicul, vas, depozit sau părti din acestea si orice alte obiecte, inclusiv materialul de ambalare desemnat ca fiind contaminat conform art 8 alin. (2) lit b), c) si d) sau desemnat ca fiind probabil contaminat în conformitate cu prevederile art. 8 alin. (2) lit. e) si alin. (4) lit. c), este decontaminat sau distrus, utilizându-se metodele prevăzute în anexa nr. VI pct. 3. După decontaminare niciun astfel de obiect nu mai este considerat ca fiind contaminat.

Art 14. - Fără a prejudicia măsurile implementate conform prevederilor art. 11-13, organismele oficiale responsabile aplică în zona demarcată conform art. 8 alin. (2) lit. f) si alin. (4) lit. c) o serie de măsuri conform prevederilor anexei nr. VI pct. 4.1 si 4.2. Detaliile acestor măsuri se notifică anual celorlalte state membre si Comisiei. Detaliile acestor notificări pot fi prezentate Comitetului.

Art. 15. - (1) Cartofii de sământă trebuie să îndeplinească cerintele Hotărârii Guvernului nr. 563/2007 si să provină, în linie directă, dintr-un material obtinut în cadrul unui program aprobat oficial, găsit liber de organism în urma testelor de laborator oficiale sau oficial supravegheate, utilizându-se metoda corespunzătoare prevăzută în anexa nr. IL

(2) Testarea prevăzută la alin. (1) este efectuată:

a) în cazurile în care a fost confirmată prezenta organismului în productia de cartofi de sământă, se testează:

1. materialul timpuriu de propagare, inclusiv clonele selectate initial si clonele de bază de cartofi de sământă;

2. toate clonele de bază de cartofi de sământă sau materialul timpuriu de propagare, inclusiv clonele selectate initial, în cazurile în care s-a stabilit că nu există nicio relatie clonală; si

b) în alte cazuri, pe fiecare plantă obtinută din clonele selectate initial sau esantioanele reprezentative de cartofi de sământă de bază ori materialul timpuriu de propagare.

(3) în conformitate cu procedura prevăzută la art. 19 alin. (2) din Hotărârea Guvernului nr. 563/2007, pot fi adoptate următoarele prevederi:

- regulile detaliate ale aplicării prevederilor alin. (2) lit. a);

- regulile privind esantioanele reprezentative prevăzute la alin. (2) lit. b).

Art. 16. - Detinerea si manipularea organismului sunt interzise.

Art. 17. - Fără a prejudicia prevederile Hotărârii Guvernului nr. 563/2007, Ministerul Agriculturii si Dezvoltării Rurale, prin Agentia Natională Fitosanitară, poate aproba derogări de la măsurile prevăzute la art. 11-14 si 16, pentru testări sau în scopuri stiintifice si lucrări pentru selectii varietale.

Art. 18. - (1) Ministerul Agriculturii si Dezvoltării Rurale, prin Agentia Natională Fitosanitară, poate adopta măsuri suplimentare sau mai stricte pentru combaterea organismului sau pentru prevenirea răspândirii lui, în conformitate cu prevederile Hotărârii Guvernului nr. 563/2007.

(2) Ministerul Agriculturii si Dezvoltării Rurale, prin Agentia Natională Fitosanitară, notifică detaliile măsurilor prevăzute la alin. (1) celorlalte state membre si Comisiei. Detaliile acestor notificări pot fi prezentate Comitetului.

Art 19. - Anexele nr. I-VII fac parte integrantă din prezentul ordin.

Art. 20. - Prezentul ordin transpune prevederile Directivei Consiliului 98/57/CEE privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., publicată în Jurnalul Oficial al Uniunii Europene (JOUE) nr. 10057 din 30 iulie 2006, modificată si completată prin Directiva Consiliului 2006/63, publicată în Jurnalul Oficial al Uniunii Europene (JOUE) nr. L 206 din 27 iulie 2006.

Art. 21. - Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 632/2002 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 327 si 327 bis din 14 mai 2003, se abrogă.

Art. 22. - Prezentul ordin se publică în Monitorul Oficial al României, Partea I.

 

Ministrul agriculturii si dezvoltării rurale,

Decebal Traian Remes

 

Bucuresti, 13 iulie 2007.

Nr. 586.

 

ANEXA Nr. I

 

SECTIUNEA I

Lista plantelor-gazdă ale bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. prevăzute la art 1

 

Plante (inclusiv tuberculi), altele decât semintele propriu-zise de Solanum tuberosum L (cartof)

Plante, altele decât fructele si semintele de Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex. Farw (tomate)

 

SECTIUNEA II

Inspectii

 

1. Inspectiile prevăzute la art. 3 din ordin se bazează pe biologia organismului si pe sistemele de productie proprii: (i) în cazul cartofului:

- în perioade corespunzătoare, inspectia vizuală a culturii si/sau prelevarea de probe atât de cartofi de sământă, cât si de alte tipuri de cartofi în perioada de vegetatie sau în perioada de depozitare. Aceste probe sunt supuse unei inspectii vizuale prin sectionarea tuberculilor; si -în cazul cartofilor de sământă si, dacă este cazul, pentru alte tipuri de cartofi se efectuează teste de laborator oficiale sau oficial supravegheate, utilizându-se metoda stabilită în anexa nr. II; (ii) în cazul tomatelor:

- inspectie vizuală, în perioade corespunzătoare, cel putin în perioada de vegetatie a plantelor destinate replantării în scop profesional. 2. Notificarea inspectiilor prevăzute la art. 4 alin. (1) din ordin include:

(i) În cazul inspectiilor asupra cartofilor:

-suprafata totală estimată cultivată, în hectare, cu cartofi de sământă si alte tipuri de cartofi;

- stratificarea după categorie a cartofilor de sământă si de consum si, după caz, pe regiune;

- numărul si perioada de prelevare a probelor pentru testare;

- numărul inspectiilor vizuale din câmp;

- numărul de inspectii vizuale asupra tuberculilor si dimensiunea probei;

(ii) În cazul inspectiilor la plantele de tomate destinate replantării în scop profesional, în perioada de vegetatie:

- numărul total estimat de plante;

- numărul inspectiilor vizuale;

(iii) În cazul inspectiilor asupra planteior-gazdă, altele decât cartofi si tomate, inclusiv plante-gazdă solanacee sălbatice:

- speciile;

- numărul si perioada prelevării probelor;

- zona/râul de unde au fost prelevate probele, acolo unde este cazul;

- metoda de analiză;

(iv) În cazul inspectiilor asupra apei si deseurilor lichide deversate din procesarea industrială sau din locurile de ambalare:

- numărul si perioada prelevării probelor;

- zona/râul/ locul de prelevare a probelor, acolo unde este cazul;

- metoda de analiză.

 

ANEXA Nr. II

 

PROTOCOLUL DE TESTARE

pentru diagnoza, detectia si identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

 

SCOPUL PROTOCOLULUI DE TESTARE

 

Protocolul prezentat descrie diversele proceduri implicate în: (i) diagnoza putregaiului brun al tuberculilor de cartof si a vestejirii bacteriene la plantele de cartof, tomate, precum si la alte câteva plante-gazdă; (ii) detectia bacteriei Ralstonia solanacearum în probele de tuberculi de cartof, plante de cartof, tomate si în alte plante-gazdă, în apă sau în sol; (iii) identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum.

 

PRINCIPII GENERALE

 

Protocoalele optimizate pentru diversele metode, validarea reactivilor si detaliile pregătirii materialului necesar pentru teste si controale figurează în apendiei. O listă a laboratoarelor care realizează optimizarea si validarea protocoalelor este prevăzută în apendicele 1.

Dat fiind faptul că protocoalele implică detectia unui organism dăunător care trebuie pus sub carantină si includ utilizarea de culturi viabile de Ralstonia solanacearum, în calitate de material de control, este necesară aplicarea de proceduri de carantină corespunzătoare care prevăd instalatii adecvate de eliminare a deseurilor si în conditiile existentei unor licente corespunzătoare eliberate de către autoritătile oficiale de carantină.

Parametrii testelor trebuie să garanteze o detectie coerentă si reproductibilă a nivelurilor de Ralstonia solanacearum la pragurile stabilite prin metodele selectionate.

Pregătirea exactă a controalelor pozitive este imperativă.

Efectuarea testelor în conformitate cu pragurile impuse implică, de asemenea, stabilirea parametrilor corecti, întretinerea si calibrarea echipamentelor, manipularea si păstrarea corectă a reactivilor si toate măsurile menite să împiedice contaminarea între probe, de exemplu, separarea controalelor pozitive si a probelor testate. Trebuie aplicate standarde de control de calitate pentru a se evita erori

administrative si de alt gen, în special în ceea ce priveste etichetarea si documentarea.

O aparitie suspectă, în sensul art. 7 alin. (1) din ordin, implică un rezultat pozitiv al testelor de diagnostic sau de detectie realizate asupra unei probe în conformitate cu diagramele functionale prezentate în continuare. Un prim test de detectie pozitiv: testul de imunofluorescentă (IF), testul reactiei de polimerizare în lant (PCR), testul de hibridizare fluorescentă in situ (FISH), izolare selectivă trebuie confirmat de un al doilea test de detectie bazat pe un alt principiu biologic.

În cazul în care primul test de detectie este pozitiv, se suspectează o contaminare cu Ralstonia solanacearum si trebuie efectuat un al doilea test de detectie. În cazul în care al doilea test de detectie este pozitiv, presupunerea se confirmă (aparitie suspectată) si trebuie continuate testele în conformitate cu procedura. În cazul în care al doilea test de detectie este negativ, proba este considerată ca fiind necontaminată cu Ralstonia solanacearum.

Prezenta confirmată mentionată la art. 8 alin. (1) din ordin implică izolarea si identificarea unei culturi pure de Ralstonia solanacearum cu confirmarea patogenitătii.

 

SECTIUNEA I

Aplicarea protocolului de testare

 

1. Procedura de detectie pentru diagnoza vestejirii bacteriene {Ralstonia solanacearum) la tuberculi de cartof, plante de cartof, plante de tomate sau alte plante-gazdă care prezintă simptome de vestejire bacteriană

Protocolul de testare este destinat tuberculilor de cartof si plantelor cu simptome tipice sau suspecte de vestejire bacteriană. Presupune un test de detectie rapidă, izolarea agentului patogen din tesutul vascular infectat pe un mediu (selectiv) si, în cazul unui rezultat pozitiv, identificarea culturii ca fiind Ralstonia solanacearum.

 

Prezentarea diagramei

 

 

 

(1)  Descrierea simptomelor este prevăzută la sectiunea 11.1.

(2) Testele de selectie rapidă usurează diagnosticul prezumtiv, dar nu sunt esentiale. Un rezultat negativ nu garantează întotdeauna absenta agentului patogen.

(3) Testul de eliminare a exsudatului din tesutul vascular al tulpinii este descris în sectiunea VI.A.1.

{4) Testul de detectie a granulelor de poli-p-hidroxibutirat în celulele bacteriene este descris în sectiunea VI.A.2.

(5) Testele de seroaglutinare asupra exsudatului bacterian sau asupra extractelor din tesuturile simptomatice sunt descrise în sectiunea VI.A.3.

(6) Testul IF asupra exsudatului bacterian, suspensiei de apă sau asupra extractelor din tesuturi simptomatice este descris în sectiunea VI.A.5.

(7) Testul FISH asupra exsudatului bacterian, suspensiei de apă sau asupra extractelor din tesuturi simptomatice este descris în sectiunea VI.A.7.

80 Testul ELISA asupra exsudatului bacterian, suspensiei de apă sau asupra extractelor din tesuturi simptomatice este descris în sectiunea VI.A.8.

(9) Testul PCR asupra exsudatului bacterian, suspensiei de apă sau asupra extractelor din tesuturi simptomatice este descris în sectiunea VI.A.6.

(10) În general, agentul patogen se izolează usor din materialul vegetal simptomatic prin însâmântare pe mediu nutritiv (sectiunea II.3).

(11) Morfologia coloniei tipice este descrisă în sectiunea II.3.d).

(12) Cultivarea riscă să esueze în stadiile avansate de infectare din cauza concurentei sau a înmultirii bacteriilor saprofite. in cazul în care simptomele bolii sunt caracteristice, dar testul de izolare este negativ, izolarea trebuie repetată, de preferintă printr-un test de însâmântare pe medii selective.

(13) Identificarea fiabilă a culturilor pure de izolate prezumtive de Ralstonia solanacearvm necesită efectuarea testelor descrise în sectiunea VI. B. O caracterizare subspecifică este facultativă, dar recomandată pentru fiecare caz nou.

(14) Testul de patogenitate este descris în sectiunea VI. C.

 

2. Procedura pentru detectia si identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probe de tuberculi de cartof asimptomatici

 

Principiu

Protocolul de testare este destinat detectiei infectiilor latente ale tuberculilor de cartof. Un rezultat pozitiv a cel putin două teste de detectie bazate pe principii biologice diferite trebuie completat prin izolarea agentului patogen, urmată, în cazul izolării coloniilor caracteristice, de confirmarea unei culturi pure ca fiind Ralstonia solanaceamm. Un rezultat pozitiv la un singur test de detectie nu este suficient pentru a considera proba ca fiind suspectă.

Testele de detectie si testele de izolare trebuie să permită detectia a 10M04 celule pe ml de extract concentrat în suspensie, incluse în fiecare serie de teste în calitate de controale pozitive.

 

Prezentarea diagramei

 

(1) Mărimea standard a probei este de 200 de tuberculi. Cu toate acestea, protocolul poate fi aplicat probelor mai mici în cazul în care nu sunt disponibili 200 de tuberculi.

(2) Extragerea agentului patogen si metodele de concentrare sunt descrise în sectiunea III. 1.1.

(3) în cazul în care cel putin două teste bazate pe principii biologice diferite sunt pozitive, trebuie efectuate izolarea si confirmarea. A se efectua cel putin un test rapid de detectie, tn cazul în care acest test este negativ, proba este considerată ca fiind negativă, fn cazul în care acest test este pozitiv, este nevoie de un al doilea sau mai multe teste de detectie rapidă bazate pe principii biologice diferite pentru a verifica primul rezultat pozitiv. Tn cazul în care al doilea test sau celelalte teste sunt negative, proba este considerată ca fiind negativă. Nu sunt necesare alte teste.

(4) Testul IF este descris în sectiunea VI.A.5.

(5) Testul de izolare selectivă este descris în sectiunea VI.A.4.

(6) Testele PCR sunt descrise în sectiunea VI.A.6.

(7) Testul FISH este descris în sectiunea VI.A.7.

(8)Testele ELISA sunt descrise în sectiunea VI.A.8.

(9) Testul biologic este descris în sectiunea VI.A.9.

(10) Morfologia tipică a coloniei este descrisă în sectiunea II.3.d).

(11) Cultivarea sau testele biologice riscă să esueze din cauza concurentei sau a inhibitiei de către bacteriile saprofite. În cazul în care se obtin rezultate pozitive dare în urma testelor rapide de detectie, însă testele de izolare sunt negative, trebuie repetate testele de izolare din acelasi extract concentrat sau din tesutul vascular suplimentar prelevat de la talonul tuberculilor tăiati din aceeasi proba si, după caz, trebuie testate probele suplimentare.

(12) Identificarea fiabilă a culturilor pure de izolate prezumtive de Ralstonia solanacearum necesită efectuarea testelor descrise în sectiunea VI.B.

(13) Testul de patogenitate este descris în sectiunea VI.C.

 

3. Procedură pentru detectia st identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probele de plante-gazdă de cartofi si tomate sau alte plante-gazdă asimptomatice

 

 

Prezentarea diagramei

 

(1) Pentru mărimea recomandată a probelor a se vedea sectiunea III.2.1.

(2) Extragerea agentului patogen si metodele de concentrare sunt descrise în sectiunea 111.2.1.

(3)în cazul tn care cel putin două teste bazate pe principii biologice diferite sunt pozitive, trebuie efectuate izolarea si confirmarea. A se efectua cel putin un test rapid de detectie, fn cazul în care acest test este negativ, proba este considerată ca fiind negativă. In cazul în care acest test este pozitiv, este nevoie de un al doilea sau mai multe teste de detectie rapidă, bazate pe principii biologice diferite, pentru a verifica primul rezultat pozitiv. În cazul în care al doilea test sau celelalte teste sunt negative, proba este considerată ca fiind negativă. Nu sunt necesare alte teste.

(4) Testul de izolare selectivă este descris în sectiunea VI.A.4.

(5)Testul IF este descris în sectiunea VI.A.5.

(6)Testele PCR sunt descrise în sectiunea VI.A.6.

(7)Testul FISH este descris în sectiunea VI.A.7.

(8)Testele ELISAsunt descrise în sectiunea VI.A.8.

(9)Testul biologic este descris în sectiunea VI.A.9.

(10) Morfologia tipică a coloniei este descrisă în sectiunea ll.3.d).

(11) Cultivarea sau testele biologice riscă să esueze din cauza concurentei sau a inhibitiei de către bacteriile saprofite. fn cazul în care se obtin rezultate pozitive clare î

în urma testelor rapide de detectie, însă testele de izolare sunt negative, trebuie repetate testele de izolare.

(12) Identificarea fiabilă a culturilor pure de izolări prezumtive de Ralstonia solanacearum se obtine prin efectuarea testelor descrise în sectiunea VI.B.

(13) Testul de patogenitate este descris în sectiunea VI.C.

 

 

SECTIUNEA a II-a

Metode detaliate pentru detectia bacteriei Ralstonia solanacearum la tuberculii de cartof, la plantele-gazdă de cartof

si de tomate sau la alte plante-gazdă cu simptome de vestejire bacteriană

 

1. Simptome (vezi website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main )

1.1. Simptome la cartof

Pe plante. Stadiul incipient al infectiei în câmp este reprezentat de vestejirea frunzelor înspre vârful plantei în timpul temperaturilor diurne ridicate si de revenirea la aspect normal în timpul noptii. În cursul primelor stadii de vestejire, frunzele rămân verzi, dar mai târziu apare o îngălbenire si o necroză brună. De asemenea, apare epinastia. Vestejirea unui lăstar sau a unor plante întregi devine repede ireversibilă si duce la moartea plantei. Tesutul vascular în sectiune transversală prin tulpina plantelor vestejite poate deveni brun si un exsudat lăptos apare la suprafata tăieturii sau poate fi extras usor prin presare. Dacă tulpina sectionată se asază în pozitie verticală în apă, din tesutul vascular se elimină un exsudat vâscos asemănător unui firicel.

Pe tuberculi. Se sectionează tuberculii de cartof transversal aproape de hil (punctul de insertie cu stolonul) sau longitudinal până la stolon. În stadiul incipient al infectiei apare o decolorare galben-sticloasă spre brun-deschis a inelului vascular din care se elimină un exsudat crem-pal în mod spontan după câteva minute. Ulterior, decolorarea vasculară devine de un brun mai distinct, iar necroza se poate extinde la tesutul parenchimatos. În stadii avansate, infectia se propagă la nivelul stolonilor si al ochilor din care se elimină bacterii ce permit aderarea particulelor de sol. Coaja tuberculilor poate prezenta leziuni de culoare brun-roscat usor adâncite, provocate de colapsul intern al tesutului vascular. In stadiile avansate ale bolii se dezvoltă putregaiuri fungice si bacteriene.

1.2. Simptome la tomate

Pe plante. Primul simptom vizibil este vestejirea aparentă a frunzelor tinere. În conditii favorabile agentului patogen (temperatura solului circa 25°C, umiditate saturată), în câteva zile apar epinastia si vestejirea unei părti din plantă sau a întregii plante, ce duc la colapsul total al plantei. În conditii mai putin favorabile (temperatura solului sub 21 °C), vestejirea este mai putin pronuntată, dar se poate dezvolta un număr mare de rădăcini adventive pe tulpină. Este posibilă observarea unei benzi subtiri unsuroase de-a lungul tulpinii, plecând de la baza acesteia, ce dovedeste necroza sistemului vascular. În cazul în care tulpina este sectionată transversal, din tesuturile vasculare brun-decolorat ale tulpinii se elimină un exsudat bacterian alb sau gălbui.

1.3. Simptome la alte plante-gazdă

Solanum dulcamara si Solanum nigrum. În conditii naturale rareori se observă simptome de vestejire la aceste plante-gazdă, cu exceptia cazurilor în care temperatura solului este mai mare de 25°C sau nivelurile de inoculum sunt extrem de ridicate (de exemplu, pentru Solanum nigrum care se dezvoltă în vecinătatea plantelor de cartof sau de tomate bolnave). În cazul în care intervine ofilirea, simptomele sunt identice cu cele descrise pentru tomată. Plantele de Solanum dulcamara care nu se vestejesc si se dezvoltă cu tulpina si rădăcina în apă pot prezenta o usoară decolorare brună a tesutului vascular pe partea transversală a tulpinii sau pe părtile tulpinii aflate sub apă. În cazul în care se pune o tulpină tăiată în pozitie verticală în apă, se pot observa fire de exsudat bacterian chiar în absenta simptomelor de vestejire.

2. Teste rapide de detectie

Testele rapide de detectie facilitează diagnosticul prezumtiv, dar nu sunt esentiale. Se folosesc unul sau mai multe dintre următoarele teste validate:

2.1. Testul eliminării exsudatului bacterian din tulpină (vezi sectiunea VI. A. 1)

2.2. Detectia granulelor de poli-B-hidroxibutirat (PHB) Granulele tipice de PHB din celulele de Ralstonia

solanacearum pot fi vizualizate prin colorarea cu albastru de Nil A sau cu negru de Sudan B (vezi sectiunea VI.A.2) a frotiurilor de exsudat bacterian din tesutul infectat, fixate prin flacără pe o lamă de microscop.

2.3. Testul serologic de aglutinare (vezi sectiunea VI.A.3)

2.4. Alte teste

Alte teste rapide de detectie sunt testul IF (vezi sectiunea VI.A.5), testul FISH (vezi sectiunea VI.A.7), testele ELISÂ(vezi sectiunea VI.A.8) si testele PCR (vezi sectiunea VI. A.6).

3. Procedura de izolare

a) Se îndepărtează exsudatul sau sectiunile de tesut decolorat de la nivelul inelului vascular al tuberculului de cartof sau din căile vasculare ale tulpinii plantei de cartof, plantei de tomată sau de alte plante-gazdă vestejite. Se pune în suspensie, într-un volum mic de apă distilată sterilă sau într-un tampon fosfat de 50 mM (apendicele 4). Se lasă 5-10 minute pe masă.

b) Se prepară o serie de dilutii zecimale ale suspensiei.

c) Se transferă 50-100 ui de suspensie si de dilutii pe un mediu nutritiv general (NA, YPGA sau SPA; vezi apendicele 2) si/sau pe mediul de tetrazolkj Kelman (apendicele 2) si/sau pe un mediu selectiv validat (de exemplu, SMSA; vezi apendicele 2). Se însământează printr-o tehnică corespunzătoare. În cazul în care se consideră util, separat, se însământează plăci Petrii cu o suspensie diluată de celule de Ralstonia solanacearum biovar 2 drept control pozitiv.

d) Se incubează plăcile timp de 2-6 zile la 28°C.

- Pe mediu nutritiv general, izolatele virulente de Ralstonia solanacearum formează colonii fluide, cu margini neregulate, plate, albicioase, deseori cu verticile caracteristice în centru. Formele avirulente de Ralstonia solanacearum formează mici colonii rotunjite, nefluide, untoase, de culoare albicioasă uniformă.

- Pe mediu tetrazoliu Kelman si pe mediu SMSA, verticilele sunt de culoare rosu-sângeriu. Formele avirulente de Ralstonia solanacearum formează colonii mici, rotunjite, untoase, nefluide de culoare rosu-închis.

4. Teste de identificare a bacteriei Ralstonia solanacearum

Testele care permit identificarea izolatelor prezumtive de Ralstonia solanacearum sunt prevăzute în sectiunea VLB.

 

SECTIUNEA a III-a

 

1. Metode detaliate pentru detectia si identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probe de tuberculi de cartof asimptomatici

1.1. Pregătirea probei

NOTE:

- Mărimea standard a unei probe este de 200 de tuberculi. O procedură mai intensivă de prelevare implică efectuarea de teste pe mai multe probe de această mărime. O probă cu un număr mai mare de tuberculi determină o inhibitie sau o interpretare dificilă a rezultatelor. Cu toate acestea, procedura se poate aplica în mod convenabil probelor cu mai putin de 200 de tuberculi.

- Validarea tuturor metodelor de detectie descrise în continuare se bazează pe efectuarea unor teste pe probe de 200 de tuberculi.

- Extractul de cartof descris în continuare poate fi, de asemenea, utilizat pentru detectia prezentei bacteriei responsabile de putregaiul inelar al cartofului, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Optiuni de pretratare care pot fi efectuate înaintea preparării probei:

a) Se incubează proba la 25-30°C până la două săptămâni pentru a favoriza înainte de efectuarea testelor multiplicarea eventualelor populatii bacteriene de Ralstonia solanacearum.

b) Se spală tuberculii. Se utilizează dezinfectanti (compusi clorurati în cazul în care testul PCR este folosit pentru a îndepărta ADN patogen) si detergenti corespunzători între fiecare probă. Tuberculii se usucă la aer. Această procedură de spălare este deosebit de utilă (dar nu obligatorie) pentru probele cu particule de sol în exces si în cazul în care se realizează un test PCR sau o procedură de izolare directă.

1.1.1. Cu un bisturiu sau un cutit pentru legume curat si dezinfectat se îndepărtează coaja de la nivelul hilului (punctul de insertie cu stolonul) fiecărui tubercul, astfel încât să fie vizibil tesutul vascular. Se taie cu atentie un miez mic de tesut vascular (con de tesut vascular) de la nivelul hilului. Cantitatea de tesut extravascular trebuie redusă la minimum (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main ).

 

notă:  - Se separă tuberculii (în putrefactie) cu simptome de putregai brun si se testează separat.

în cazul în care, la îndepărtarea conului de tesut vascular de la nivelul hilului, se observă simptome de putregai brun, trebuie să se realizeze o examinare vizuală a tuberculului respectiv si o sectionare a acestuia lângă nil. Orice tubercul tăiat care prezintă simptome suspecte trebuie păstrat timp de cel putin două zile la temperatura ambiantă pentru a permite formarea unui strat de suber, iar apoi depozitat la o temperatură de refrigerare (între 4 si 10°C) în conditii de carantină corespunzătoare. Toti tuberculii, inclusiv cei cu simptome suspecte, trebuie păstrati în conformitate cu anexa nr. III.

1.1.2. Se colectează conurile în recipiente de unică folosintă neutilizate care pot fi închise si/sau sigilate (în cazul în care recipientele sunt refolosite, ele trebuie spălate si dezinfectate cu compusi ctorinatj). Este preferabil ca conurile să fie prelucrate imediat. În cazul în care nu este posibil, acestea se depozitează în recipiente, fără adăugarea unui tampon, pentru cel mult 72 de ore în frigider si cel mult 24 de ore la temperatura ambiantă.

Se prelucrează conurile prin una dintre următoarele proceduri:

a) se acoperă conurile cu un volum suficient (circa 40 ml) de tampon de extractie (apendicele 4) si se agită pe un agitator rotativ (50-100 turatii/minut) timp de 4 ore la o temperatură mai mică de 24°C sau la o temperatură de refrigerare timp de 16-24 de ore; sau

b) conurile se omogenizează cu un volum suficient (circa 40 ml) de tampon de extractie (apendicele 4) într-un mixer (de exemplu, Waring sau Ultra Thurax) sau se măruntesc într-un sac de macerare de unică folosintă sigilat (de exemplu, sac Stomacher sau de tip „Bioreba strong gauge polythene" de 150 mm x 250 mm sterilizat prin radiatii) cu ajutorul unui ciocan de cauciuc sau al unui dispozitiv de măcinare corespunzător (de exemplu, Homex).

notă.- Riscul de contaminare încrucisată a probelor este considerabil în cazul în care probele sunt omogenizate într-un mixer. Ase lua măsuri de precautie pentru a se evita producerea de aerosoli sau scurgeri în timpul procesului de extractie. A se utiliza palete de mixer si recipiente sterilizate pentru fiecare probă. La efectuarea testului PCR, se evită transferul de ADN pe recipientele sau dispozitivele de măcinare. În cazul în care se recurge la testul PCR, se recomandă măcinarea în saci de unică folosintă si utilizarea de tuburi de unică folosintă.

1.1.3. Se decantează supernatantul. În cazul în care acesta este prea tulbure, se filtrează printr-o centrifugare la viteză mică (la 180 g maximum timp de 10 minute, la o temperatură de 4-10°C) sau printr-o filtrare în vid (40-100 um), spălându-se filtrul cu un tampon de macerare suplimentar (10 ml).

1.1.4. Bacteriile se concentrează prin centrifugare la 7.000 g timp de 15 minute (sau la 10.000 g timp de 10 minute) la o temperatură de 4-10°C si se îndepărtează supernatantul fără a deranja sedimentul (extract concentrat).

1.1.5. Sedimentul se resuspendă în 1,5 ml tampon concentrat (apendicele 4). Se folosesc 500 μl pentru a testa Ralstonia solanacearum, 500 μl pentru Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus si 500 μl pentru referintă. Se adaugă giicerol steril la concentratia finală de 10-25 % (volum) la 500 μl de alicote de referintă si la alicota de testare rămasă, se omogenizează în vortex si se depozitează la o temperatură situată între -16 si - 24°C (săptămâni) sau între - 68 si - 86°C (luni). Alicotele de testare se păstrează în timpul testelor la o temperatură de 4-10°C.

Nu se recomandă congelările si decongelările repetate, în cazul în care extractele trebuie transportate, livrarea trebuie efectuată într-o geantă frigorifică în termen de 24 de ore.

1.1.6. Este absolut necesar ca toate controalele pozitive de Ralstonia solanacearum si probele să fie tratate separat pentru a evita orice contaminare. Această conditie se aplică atât pentru lamele de imunofluorescentă, cât si pentru toate testele.

1.2. Testele

Ase vedea diagrama si descrierea testelor si a protocoalelor optimizate în apendicele corespunzătoare:

Izolare selectivă (vezi sectiunea VI.A.4)

Testul IF (vezi sectiunea VI.A.5)

Testele PCR (vezi sectiunea VI.A.6)

Testul FISH (vezi sectiunea VI.A.7)

Testele ELISA (vezi sectiunea VI.A.8)

Testul biologic (vezi sectiunea VI.A.9)

2. Metode detaliate pentru detectia si identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probe de plante de cartof si plante de tomate sau alte plante-gazdă asimptomatice

2.1. Pregătirea probei

notă: Pentru detectia populatiilor latente de Ralstonia solanacearum, se recomandă testarea unor serii de probe. Procedura poate fi aplicată cu usurintă probelor care contin până la 200 de bucăti de tulpini. În cazul în care se efectuează supravegheri, acestea trebuie bazate pe o probă reprezentativă din punct de vedere statistic pentru populatia vegetală în cauză.

2.1.1. Se colectează bucăti de tulpină de 1-2 cm într-un recipient steril închis, în conformitate cu următoarele proceduri de prelevare:

Plantule de tomată (răsaduri): cu ajutorul unui cutit curat si dezinfectat se taie o bucată de 1 cm la baza fiecărei tulpini, chiar deasupra nivelului solului.

Plante de tomate cultivate în seră sau în câmp: cu ajutorul unui cutit curat si dezinfectat se îndepărtează lăstarul cel mai de jos al fiecărei plante, tăind chiar deasupra jonctiunii cu tulpina principală. Se îndepărtează o bucată de 1 cm de la baza fiecărui lăstar lateral.

Alte plante-gazdă: cu ajutorul unui cutit sau al unei foarfeci de grădină curate si dezinfectate se taie o bucată de 1 cm de la baza fiecărei tulpini, chiar deasupra nivelului solului. În cazul buruienii Solanum dulcamara sau al altor plante-gazdă care cresc în apă, se taie bucăti de 1-2 cm din tulpinile care se găsesc sub apă sau din stolonii cu rădăcini acvatice.

în caz de prelevare într-o anumită zonă, se recomandă să se testeze o probă reprezentativă din punct de vedere statistic de cel putin 10 plante pe punct de prelevare pentru fiecare potentială buruiană-gazdă. Detectia agentului patogen se face

în modul cel mai fiabil la sfârsitul primăverii, vara si toamna, desi infectiile naturale pot fi detectate pe tot parcursul anului la plantele perene de Solanum dulcamara care cresc în apă. Gazdele cunoscute sunt plantele spontane de cartof, Solanum dulcamara, Solanum nigmm, Datura stramonium si alte specii din familia Solanaceae. Pelargonium spp. si Portulaca oleracea sunt, de asemenea, plante-gazdă. Printre anumite buruieni europene care pot găzdui la nivelul rădăcinii si/sau rizosferei tulpini virulente de Ralstonia solanacearum biovar 2, rasa 3, în conditii de mediu specifice, se numără Atriplex hastata, Bidens μllosâ, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Silene alba, S. nutans, Tussilago farfanra si Urtica dioica.

 

notă: în această etapă se poate efectua examinarea vizuală a simptomelor interne (coloratie vasculară sau exsudat bacterian). Se separă orice bucată de tulpină cu simptome si se testează în mod separat (vezi sectiunea II).

2.1.2. Se efectuează o dezinfectare scurtă a bucătilor de tulpină cu etanol de 70% si se usucă de îndată cu ajutorul hârtiei absorbante. Apoi se prelucrează bucătile de tulpină în conformitate cu una dintre următoarele proceduri:

a) se acoperă cu un volum suficient (circa 40 ml) de tampon de extractie (apendicele 4) si se agită pe un agitator rotativ (50-100 turatii/minut) timp de 4 ore la o temperatură mai mică de 24°C sau la o temperatură de refrigerare timp de 16-24 de ore; sau

b) bucătile de tulpină se zdrobesc de îndată într-un sac de macerare rezistent (de exemplu, Stomacher sau Bioreba) cu un

volum corespunzător de tampon de extractie (apendicele 4), cu ajutorul unui ciocan de cauciuc sau al unui dispozitiv de măcinare corespunzător (de exemplu, Homex). În cazul în care acest lucru nu este posibil, bucătile se păstrează, fără a depăsi 72 de ore, la temperatură de refrigerare sau 24 de ore la temperatura ambiantă.

2.1.3. Se decantează supernatantul după o sedimentare de 15 minute.

2.1.4. De obicei, nu este necesară o limpezire suplimentară a extractului sau a concentratului decantat, dar poate fi realizată prin filtrare si/sau centrifugare în conformitate cu metoda prevăzută la pct. 1.1.3-1.1.5.

2.1.5. Se împarte extractul initial sau concentrat în două părti egale. Se păstrează jumătate la o temperatură de 4-10°C pe parcursul testului si se conservă cealaltă jumătate cu 10-25 % (volum) glicerol steril la o temperatură situată între -16 si - 24°C (săptămâni) sau între - 68 si - 86°C (luni), în cazul în care este necesar un test suplimentar.

2.2. Teste

A se vedea diagrama si descrierea testelor si protocoalelor optimizate în apendicele corespunzătoare: Izolarea selectivă (vezi sectiunea VI. A.4) Testul IF (vezi sectiunea VI. A.5) Testele PCR (vezi sectiunea VI. A.6) Testul FISH (vezi sectiunea VI. A.7) Testele ELISA (vezi sectiunea VI. A.8) Testul biologic (vezi sectiunea VI. A.9)

 

SECTIUNEA a IV-a

1. Procedură pentru detectia si identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în apă

 

Prezentarea diagramei

 

2. Metode pentru detectia si identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în apă

Principiu

Procedura de detectie validată descrisă în prezenta sectiune se aplică pentru detectia agentului patogen în probe de apă de suprafată si poate fi folosită, de asemenea, pentru a testa probele de deseuri lichide provenite din prelucrarea cartofilor sau probele provenite din ape reziduale. Cu toate acestea, trebuie retinut faptul că sensibilitatea de detectie variază în functie de substrat. Sensibilitatea testului de izolare este afectată de populatiile de bacterii saprofite concurente care sunt, în general, mult mai numeroase în probele provenite din prelucrarea cartofilor si din ape reziduale decât în apele de suprafată. În timp ce procedura descrisă în continuare trebuie să detecteze numai 103 celule/l în apele de suprafată, sensibilitatea de detectie în deseurile provenite din prelucrarea cartofilor sau ape reziduale poate fi mult mai slabă. Din acest motiv, se recomandă testarea deseurilor după eventualele tratamente de purificare (de exemplu, sedimentare sau filtrare) pe parcursul cărora se reduc populatiile de bacterii saprofite. Limitele sensibilitătii procedurii de testare trebuie avute în vedere atunci când se evaluează fiabilitatea rezultatelor negative obtinute, după caz. Desi această procedură a fost efectuată cu succes în studiile destinate să stabilească prezenta sau absenta agentului patogen în apele de suprafată, limitele sale trebuie luate în considerare atunci când este utilizată în lucrări asemănătoare privind deseurile provenite din prelucrarea cartofilor sau apelor reziduale.

2.1. Pregătirea probei

 

NOTE:

- Detectia bacteriei Ralstonia solanacearum în apele de suprafată se face în mod mai fiabil la sfârsitul primăverii, vara si toamna, atunci când temperatura apei este mai mare de 15°C.

- Reînceperea prelevării în momente diferite pe parcursul perioadei mentionate anterior în punctele de prelevare desemnate va spori fiabilitatea detectiei, reducând consecintele variatiilor climatice.

- Trebuie să se tină seama de consecintele ploilor abundente si de geografia cursului apei pentru a evita efectele de diluare considerabile care pot ascunde prezenta agentului patogen.

- Se prelevă probe de apă de suprafată în apropierea plantelor-gazdă în cazul în care aceste plante-gazdă sunt prezente.

2.1.1. În punctele de prelevare selectionate, probele de apă se colectează prin umplerea unor tuburi sau sticle sterile de unică folosintă la o adâncime, atunci când este posibil, mai mare de 30 cm si la o distantă maximă de 2 m de la mal. Pentru deseurile provenite din prelucrarea cartofilor sau pentru apele reziduale, se colectează probe din punctul de deversare a acestora. Mărimea recomandată a probelor poate atinge 500 ml pe punct de prelevare. În cazul în care se preferă probe mai mici, se recomandă prelevarea probelor cel putin în 3 reprize pe punct de prelevare, fiecare probă constând din două subprobe duplicate de cel putin 30 ml. Pentru un studiu intensiv, se selectionează cel putin 3 puncte de prelevare pentru 3 km de curs al apei si se prelevă si din afluentii cursului de apă.

2.1.2. Se transportă probele în conditii de refrigerare (4-10°C) si la întuneric si se testează pe parcursul a 24 de ore.

2.1.3. La nevoie, probele pot fi concentrate prin una dintre următoarele metode:

a) se centrifughează 30-50 ml de subprobă la 10.000 g timp de 10 minute (sau la 7.000 g timp de 15 minute), preferabil la 4-10°C, se îndepărtează supernatantul, iar sedimentul se resuspendă în 1 ml de tampon concentrat (vezi apendicele 4).

b) Filtrare pe membrană (dimensiunea minimă a porilor, de 0,45 um) urmată de spălarea filtratului în 5-10 ml de tampon concentrat si retinerea solutiilor de spălare. Această metodă este adecvată pentru volume mari de probe de apă, cu continut mic de organisme saprofite.

În general, concentrarea nu se recomandă pentru probele de deseuri provenite din prelucrarea cartofilor sau din ape reziduale, dat fiind faptul că populatiile mai mari de bacterii saprofite concurente vor avea un efect inhibitor asupra detectiei bacteriei Ralstonia solanacearum.

2.2. Teste

A se vedea diagrama si descrierea testelor în apendicii corespunzători.


(1) A se vedea sectiunea IV.2.1 pentru procedurile de prelevare recomandate.

(2) Metodele de concentrare a agentului patogen sunt descrise în sectiunea IV.2.1. Concentrarea sporeste populatiile agentului patogen si ale bacteriilor saprofite concurente si este recomandată numai în cazul în care nu determină inhibarea testului de izolare.

(3) Testul de izolare selectivă este descris în sectiunea VI.A.4.

(4)Testul biologic este descris în sectiunea VI.A.9.

(5) Metodele de îmbogătire PCR sunt descrise în sectiunile VI.A.4.2 si VI.A.6.

(6) Metodele de îmbogătire EUSAsunt descrise în sectiunile VI.A.4.2 si VI.A.8.

(7) Morfologia tipică a coloniei este descrisă în sectiunea ll.3.d).

(8) Cultivarea riscă să esueze din cauza concurentei sau a efectului inhibitor al bacteriilor saprofite. Tn cazul în care populatiile mari de saprofite sunt suspectate că ar putea afecta fiabilitatea izolării, testele de izolare trebuie reîncepute după diluarea probei în apă sterilă.

(9) Identificarea fiabilă a culturilor pure de izolate prezumtive de Ralstonia solanacearum necesită efectuarea testelor descrise la sectiunea VI.B. (™) Testul de patogenitate este descris în sectiunea VI.C.

 

 

SECTIUNEA a V-a

1. Procedură pentru detectia si identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în sol

 

Prezentarea diagramei

 

(1)A se vedea pct. V.2.1 pentru procedurile de prelevare recomandate.

(2) Testul de izolare selectivă este descris fn sectiunea VI.A.4.

(3) Metodele de îmbogătire PCR sunt descrise în sectiunile VI.A.4.2 si VI.A.6. (4)Testul biologic este descris în sectiunea VI.A.9.

(5) Morfologia tipică a coloniei este descrisă în sectiunea ll.3.d.

(6) Cultivarea riscă să esueze din cauza concurentei sau a efectului inhibitor al bacteriilor saprofite. In cazul în care populatiile mari de bacterii saprofite sunt suspectate că ar putea afecta fiabilitatea izolării, testele de izolare trebuie reîncepute după o nouă dilutie a probei.

(7) Identificarea fiabilă a culturilor pure prezumtive de Ralstonia solanacearum necesită efectuarea testelor descrise la sectiunea VI.B. WTestul de patogenitate este descris în sectiunea VI.C.

 

2. Metode pentru detectia si identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în sol

Principii

Procedura de detectie validată descrisă în prezenta sectiune se aplică pentru detectia agentului patogen în probe de sol, dar poate fi, de asemenea, utilizată pentru a testa probele de deseuri solide provenite din prelucrarea cartofilor sau a nămolului de epurare. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că aceste metode nu sunt destul de sensibile pentru a garanta detectia populatiilor de Ralstonia solanacearum cu densitate mică sau dispersate inegal, care ar putea apărea în probele infectate în mod natural cu aceste substraturi.

Limita de sensibilitate a acestei proceduri de testare trebuie avută în vedere la evaluarea fiabilitătii rezultatelor negative obtinute si, de asemenea, la utilizarea sa în studiile destinate să stabilească prezenta ori absenta agentului patogen în soluri sau în nămol. Cel mai fiabil test de detectie a prezentei agentului patogen în solul unui câmp este plantarea unei plante-gazdă sensibile si supravegherea infectării eventuale a acesteia, însă nici această metodă nu va permite detectia unui nivel slab de contaminare.

2.1. Pregătirea probei

2.1.1. Prelevarea solului din câmp trebuie să respecte standardele de bază utilizate pentru prelevarea nematozilor. Se colectează 0,5-1 kg de sol per probă în 60 de puncte, pe o suprafată de 0,3 ha, la o adâncime de 10-20 cm (sau dintr-o grilă de 7 x 7 m). În cazul în care se suspectează prezenta agentului patogen, se măreste numărul de puncte de colectare la 120 pe o suprafată de 0,3 ha. Înainte de testare, probele se păstrează la o temperatură de 12-15°C. Se colectează în total 1 kg de nămol provenit din prelucrarea cartofilor si nămol de epurare în locurile care reprezintă volumul total de nămol de testat. Înainte de testare, fiecare probă se amestecă bine.

2.1.2. Se împart probele în subprobe de 10-25 g de sol sau de nămol cu ajutorul unui agitator rotativ (250 turatii/minut) în tampon de extractie de 60-150 ml (apendice 4) timp de două ore cel mult. După caz, pentru a favoriza dispersia, se adaugă 0,02 % de Tween 20 steril si 10-20 g de μletris steril.

2.1.3. Suspensia se păstrează, în timpul testului, la 4°C. 2.2. Teste

A se vedea diagrama si descrierea testelor în apendicii corespunzători.

 

SECTIUNEA a Vl-a

Protocoale optimizate pentru detecpa si identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum

 

A. DIAGNOSTIC Sl TESTE DE DETECTIE

1. Testul eliminării exudatului bacterian din tulpină

Prezenta bacteriei Ralstonia solanacearum în tulpini ofilite de cartof, tomate sau de alte plante-gazdă poate fi pusă în evidentă prin următorul test simplu prezumtiv: se sectionează tulpina chiar deasupra nivelului solului. Se suspendă extremitatea tăiată într-un tub cu apă curată. După câteva minute se observă scurgeri spontane si caracteristice de fire de exudat bacterian din fasciculele vasculare tăiate.

2. Detectia granulelor de poli-B-hidroxibutirat

1. Se prepară un frotiu din exudatul bacterian scurs din tesutul infectat pe o lamă de microscop sau se prepară un frotiu dintr-o cultură de 48 de ore de pe mediu YPGA sau SPA (apendice 2).

2. Se prepară frotiuri de control pozitiv din culturi de Ralstonia solanacearum biovar 2 si, în cazul în care se consideră necesar, un frotiu de control negativ cunoscut PHB negativ.

3. Se lasă la uscat si se trece rapid partea inferioară a fiecărei lame de câteva ori prin flacără până la fixarea frotiului.

4. Se colorează frotiul preparat cu albastru de Nil sau negru de Sudan si se examinează la microscop după cum urmează.

Testul cu albastru de Nil

a) Fiecare lamă se scufundă într-o solutie apoasă 1 % de albastru de Nil A si se incubează 10 minute la 55°C.

b) Se scurge solutia colorantă. Se spală rapid sub jet de apă. Excesul de apă se îndepărtează cu hârtie absorbantă.

c) Frotiul se scufundă într-o solutie apoasă de acid acetic de 8 % si se incubează un minut la temperatura ambiantă.

dj Se spală rapid sub jet de apă. Excesul de apă se îndepărtează cu hârtie absorbantă.

e) Se umezeste cu o μlcătură de apă si se aplică o lamelă de acoperire.

f) Se examinează frotiul colorat la un microscop cu epifluorescentă de 450 nm cu ulei de imersie, la o mărire de 600-1.000, folosindu-se un obiectiv de imersie în ulei sau în apă.

g) Se observă fluorescenta portocalie strălucitoare a granulelor PHB. De asemenea, se observă la lumină albă pentru a avea certitudinea că granulele sunt intracelulare si că morfologia celulei este tipică pentru Ralstonia solanacearum.

Testul cu negru de Sudan

a) Fiecare lamelă se scufundă într-o solutie de 0,3 % negru de Sudan B în 70 % etanol si se incubează 10 minute la temperatura ambiantă.

b) Se scurge solutia colorantă si se spală rapid sub jet de apă. Se îndepărtează excesul de apă cu hârtie absorbantă.

c) Lamele se trec rapid prin xilol si se usucă cu hârtie absorbantă. Atentie! Xilolul este un produs periculos. Luati măsurile de precautie necesare si lucrati într-o hotă chimică.

d) Se scufundă lamele în solutie apoasă de safranină 0,5 % si se lasă 10 secunde la temperatura ambiantă. Atentie! Safranină este un produs periculos. Luati măsurile de precautie necesare si lucrap într-o hotă chimică.

e) Se spală sub jet de apă. Se usucă cu hârtie absorbantă si se acoperă cu o lamelă.

f) Se examinează frotiul colorat la un microscop optic, folosindu-se obiectivul de imersie la o mărire de 1.000.

g) Se observă granulele de PHB în celulele de Ralstonia solanacearum care se colorează în albastru-negru. Membrana celulară se colorează în roz.

3. Teste serologice de aglutinare

Aglutinarea celulelor de Ralstonia solanacearum în exudatul bacterian sau în extractele de tesuturi simptomatice se observă cel mai bine folosindu-se anticorpi validati (vezi apendice 3) etichetati cu markeri colorati corespunzători, precum celulele de Staphylococcus aureus rosu sau particule de latex colorate. În caz de utilizare a unui material disponibil în comert (vezi apendice 3), se urmează instructiunile producătorului, tn caz contrar, se urmează procedura descrisă în continuare:

a) Se amestecă μlcăturile unei suspensii de anticorpi si de exudat bacterian marcate (circa 5 μl în fiecare caz) pe ferestrele lamelor detestare cu multe godeuri;

b) Se prepară suspensii de control pozitiv si negativ din suspensii de Ralstonia solanacearum biovar 2 si dintr-o tulpina heterologă;

c) Se observă aglutinarea în probele pozitive după o omogenizare usoară timp de 15 secunde.

4. Izolarea pe mediu selectiv

4.1. fnsământare pe mediu selectiv

notA: înainte de aplicarea acestei metode pentru prima dată, se efectuează teste preliminarii pentru a garanta o detectie reproductibilă a 103-104 celule formatoare de coloniu (cfu) per ml de Ralstonia solanacearum adăugată la extractele care au dat rezultate negative la testele anterioare.

Se foloseste un mediu selectiv validat corespunzător, de exemplu, SMSA (modificat de Elphinstone ef al., 1996; vezi apendicele 2).

De asemenea, trebuie diferentiată Ralstonia solanacearum de alte bacterii care pot dezvolta colonii în mediul respectiv. În plus, coloniile de Ralstonia solanacearum pot prezenta o morfologie atipică în cazul în care plăcile sunt suprapopulate sau în cazul în care sunt, de asemenea, prezente bacterii antagoniste. În cazul în care se suspectează efectele de concurentă sau de antagonism, proba trebuie testată din nou, utilizându-se o metodă de testare diferită.

Cea mai mare sensibilitate de detectie, în cadrul acestei metode, poate fi atinsă în cazul în care se folosesc extracte de probe proaspăt preparate. Cu toate acestea, metoda se aplică, de asemenea, extractelor cu glicerol păstrate la o temperatură cuprinsă între - 68 si - 86°C.

Se prepară, pentru control pozitiv, dilutii zecimale de suspensie de 106 ufc/ml dintr-o tulpină virulentă biovar 2 de Ralstonia solanacearum (de exemplu, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Pentru a se evita orice posibilitate de contaminare, controalele pozitive se prepară complet separat de probele de testat.

Pentru fiecare lot de mediu selectiv proaspăt pregătit, acesta trebuie testat pentru a se vedea dacă este propice înmultirii agentului patogen înainte de a-l utiliza pentru testarea probelor de rutină.

Materialul de control se testează în acelasi mod ca si probele.

4.1.1. Testul se efectuează cu ajutorul unei tehnici corespunzătoare de însământare cu scopul de a asigura diluarea întregii populatii care formează colonii de saprofite. Se însământează 50-100 μl din fiecare probă de extract si fiecare dilutie.

4.1.2. Plăcile se incubează la 28°C. Citirea plăcilor se face după 48 de ore, iar apoi zilnic pe o perioadă de până la 6 zile. Coloniile tipice de Ralstonia solanacearum în mediul nutritiv SMSA sunt de culoare alb-lăptos, plate, neregulate si fluide, iar după 3 zile de incubare dezvoltă o coloratie roz spre rosu-sângeriu în centru, prezentând spirale sau striatii interne sau verticile (a se vedea website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/i rc/sanco/Home/main).

notă: Uneori, în acest mediu se formează colonii atipice de Ralstonia solanacearum. Ele pot fi mici, în întregime de culoare rosie si nefluide sau partial fluide, fiind, prin urmare, greu de deosebit de bacteriile saprofite care formează colonii.

4.1.3. Coloniile prezumtive de Ralstonia solanacearum se purifică după însământare si însământare pe mediu nutritiv general pentru a obtine colonii izolate (a se vedea apendicele 2).

4.1.4. Culturile pot fi păstrate pe termen scurt în apă sterilă (pH 6-8, fără clor) la temperatura ambiantă la întuneric sau pe termen lung într-un mediu crioprotector corespunzător între - 68 si - 86°C sau liofilizate.

4.1.5. Se identifică culturile prezumtive (vezi sectiunea VI. B) si se efectuează un test de patogenitate (vezi sectiunea VI. C).

 

Interpretarea rezultatelor testului de izolare pe mediu selectiv

Testul de însământare pe mediu selectiv este negativ atunci când după 6 zile nu sunt observate colonii bacteriene sau atunci când nu sunt observate colonii caracteristice Ralstonia solanacearum, cu conditia să nu fie suspectată o inhibitie datorată competitiei sau antagonismului cu alte bacterii si în cazul controalelor pozitive să fie observate colonii caracteristice de Ralstonia solanacearum.

Testul de însământare pe mediu selectiv este pozitiv atunci când sunt observate colonii prezumtive de Ralstonia solanacearum.

4.2. Procedura de îmbogătire

A se utiliza un mediu de îmbogătire validat precum mediul nutritiv modificat Wilbrink (a se vedea apendicele 2).

Această procedură poate fi folosită pentru a creste în mod selectiv populatiile de Ralstonia solanacearum în probe si pentru a creste sensibilitatea detectiei Procedura permite, de asemenea, diluarea eficientă a inhibitorilor reactiei PCR (1:100). Cu toate acestea, trebuie notat faptul că îmbogătirea bacteriei Ralstonia solanacearum poate esua din cauza concurentei sau antagonismului organismelor saprofite care sunt de multe ori îmbogătite simultan. În consecintă, izolarea bacteriei Ralstonia solanacearum pe medii nutritive de cultură îmbogătite poate fi dificilă. De asemenea, întrucât populatiile de saprofite apropiate din punct de vedere serologic se pot înmulti, în cazul utilizării testului ELISA, se recomandă utilizarea de anticorpi monoclonali specifici în locul anticorpilor policlonali.

4.2.1. îmbogătirea pentru PCR presupune transferul a 100 μl de extract de probă în 10 ml de mediu nutritiv lichid de îmbogătire (apendicele 2) alicotat anterior în tuburi sau flacoane fără urme de ADN. Pentru îmbogătirea ELISA, se pot folosi proportii mai mari de mediu nutritiv lichid (de exemplu, 100 μl în 1,0 ml de mediu nutritiv lichid de îmbogătire).

4.2.2. Se incubează timp de 72 de ore între 27 si 30°C într-o cultură agitată sau statică fără a închide ermetic dopul tubului, pentru a permite aerisirea.

4.2.3. Se amestecă bine înainte de a se utiliza pentru testele ELISA sauPCR.

4.2.4. În testele anterioare, mediul nutritiv lichid de îmbogătire se tratează în acelasi mod ca si probele.

 

notă: În cazul în care se prevede o inhibitie a îmbogătirii bacteriei Ralstonia solanacearum din cauza populatiilor considerabile de anumite bacterii saprofite concurente, îmbogătirea extractelor de probe înainte de centrifugare sau alte etape de concentrare pot determina obtinerea unor rezultate mai bune.

 

5. Testul de imunofluorescentă

Principiu

Tinându-se seama de capacitatea sa recunoscută de a atinge pragurile impuse, se recomandă utilizarea testului de imunofluorescentă ca principal test de detectie rapidă.

În cazul în care testul de imunofluorescentă este utilizat ca principal test detectie rapidă si rezultatul lui este pozitiv, trebuie efectuat un test de izolare, uri test PCR sau un test FISH drept test secundar. În cazul în care testul de imunofluorescentă este utilizat ca test secundar si rezultatul lui este pozitiv, analiza trebuie completată cu teste suplimentare după cum prevede diagrama functională.

notă: Se utilizează o sursă validată de anticorpi de Ralstonia solanacearum (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main ). Se recomandă stabilirea titrului pentru fiecare lot nou de anticorpi. Titrul se defineste ca fiind cea mai mare dilutie la care se obtine o reactie optimă atunci când se testează o suspensie de 105-106 celule pe ml din tulpina omologă de Ralstonia solanacearum foiosindu-se un conjugat corespunzător de izotiocianat de fluoresceină (FITC), în conformitate cu recomandările producătorului. Toate an ti serurile policlonale validate au un titru de imunofluorescentă de cel putin 1: 2.000. La efectuarea testului, dilutiile de lucru ale anticorpilor trebuie să fie aproximativ egale sau egale cu cele ale titrului.

Testul trebuie efectuat cu extracte de probe proaspăt preparate. După caz, se pot folosi si extracte conservate în solutie de glicerol la o temperatură cuprinsă între - 68°C si -86°C. Glicerolul poate fi separat de probă prin adăugarea a 1 ml de tampon concentrat (vezi apendicele 4), recentrifugarea timp de 15 minute la 7.000 g si resuspendarea în acelasi volum de tampon concentrat. Acest lucru este rareori necesar, mai ales atunci când probele sunt fixate de lame prin flambare.

Separat se prepară lame de control pozitiv dintr-o tulpină omologă sau orice altă tulpină de referintă de Ralstonia solanacearum în suspensie în extract de cartof, după cum prevede apendicele 3 B, si, facultativ, în tampon.

În cazul în care este posibil, ar trebui să se folosească drept control similar pe aceeasi lamă tesut infectat în mod natural (conservat prin liofilizare sau congelare la o temperatură între -16 si - 24°C).

În calitate de control negativ, se pot folosi alicote de extracte de probe care au dat rezultate negative la testele anterioare de detectie a bacteriei Ralstonia solanacearum.

Materialele de control pozitiv si negativ standardizate disponibile pentru acest test sunt prevăzute în apendicele 3.

Se folosesc pentru microscop lame cu multe godeuri, având, de preferintă, 10 ferestre cu diametru de cel putin 6 mm.

Materialul de control se testează în acelasi mod ca si probele.

5.1. Lamele-test se prepară folosiridu-se una dintre următoarele metode:

(i) Extracte concentrate cu relativ putin amidon:

Se μlpetează un volum standard (15 μl este adecvat unui godeu de 6 mm diametru - volumul se măreste pentru godeuri cu diametru mai mare) dintr-o dilutie de 1/100 de sediment resuspendat în primul godeu. Apoi se μlpetează un volum similar de sediment nediluat (1/1) în godeurile rămase din primul rând al lamei. Al doilea rând poate fi folosit ca duplicat sau pentru o a doua probă, în conformitate cu cele indicate în figura 1.

(ii) Pentru alte extracte concentrate:

Se pregătesc dilutii zecimale (1/10,1/100) din sedimentul resuspendat în tampon concentrat. Se μlpetează un volum standard (15 μl este adecvat unui godeu de 6 mm diametru - volumul se măreste pentru godeuri cu un diametru mai mare) din sedimentul resuspendat si din fiecare dilutie pe un rând de godeuri. Al doilea rând poate fi folosit ca duplicat sau pentru o a doua probă, în conformitate cu cele prezentate în figura 2.

5.2. Se lasă μlcăturile să se usuce la temperatura ambiantă sau prin încălzire la o temperatură de 40-45°C. Celulele bacteriene se fixează pe lamă fie prin încălzire (15 minute la 60CC), trecere prin flacără, cu 95 % etanol sau în conformitate cu instructiunile specifice ale furnizorilor de antiseruri.

în cazul în care este necesar, lamele fixate pot fi stocate la congelator într-o cutie uscată, atât cât este necesar (cel mult 3 luni), înainte de un nou test.

5.3. Procedura testului de imunofluorescentă

(i) în conformitate cu metoda de pregătire a lamelor-test indicată la pct. 5.1 (i):

Se prepară un set de dilutii de 1/2. În primul godeu dilutia ar trebui să fie de 1/2 din titru (T/2), celelalte fiind de 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titru (T) si de două ori titrul (2T). (ii) în conformitate cu metoda de pregătire a lamelor-test indicată la punctul 5.1 (ii):

Se prepară dilutia de lucru a anticorpilor în tampon IF.

Dilutia de lucru are efect asupra specificitătii.

 

 

Figura 1: Pregătirea lamei-test în conformitate cu pct. 5.1 (i) si 5.3 (i)

 

Dilutii ale extractului concentrat resuspendat

 

 

1/100

1/1

1/1

1/1

1/1

Dilutii ale extractului concentrat resuspendat

(T = titru)

T/2

T/4

T/2

T

2T

Dilutii duble ale antiserului/anticorpilor

 

Proba 1

 

1

2

3

4

5

duplicat proba 1 sau proba 2

 

6

7

8

9

10

 

Figura 2: Pregătirea lamei-test în conformitate cu pct. 5.1 (ii) si 5.3 (ii)

 

Dilutie de lucru a antiserului/anticorpilor

 

 

 

 

 

 

Dilutie zecimală a sedimentului resuspendat

1/1

1/10

1/100

gol

gol

 

 

Proba 1

 

1

2

3

4

5

duplicat proba 1 sau proba 2

 

6

7

8

9

10

 

5.3.1. Lamele se asază pe hârtie absorbantă umedă. Se acoperă complet fiecare godeu de test cu dilutia sau dilutiile de anticorpi. Volumul de antiser μlpetat în fiecare godeu trebuie să fie cel putin echivalent cu volumul de extract μlpetat pe lamă.

Următoarea procedură ar trebui aplicată în absenta instructiunilor specifice ale furnizorilor de anticorpi:

5.3.2. Se incubează lamele pe hârtie umedă acoperite timp de 30 de minute la temperatura ambiantă (18-25°C).

5.3.3. Se îndepărtează antiserul de pe fiecare lamă si se spală lamele cu atentie cu tamponul IF. Se spală prin imersare în solutie tampon IF-Tween (apendice 4) timp de 5 minute si apoi în tampon IF. Se evită formarea de aerosoli sau transferul de μlcături care ar putea conduce la o contaminare încrucisată. Excesul de tampon IF se îndepărtează cu grijă cu o hârtie de filtru.

5.3.4. Lamele se asază pe hârtie umedă. Se acoperă godeurile lamelor-test cu dilutii ale conjugatului FITC utilizat pentru determinarea titrului. Volumul de conjugat μlpetat în godeuri trebuie să fie egal cu volumul de anticorpi μlpetat.

5.3.5. Se incubează lamele pe hârtie umedă, acoperite, timp de 30 de minute la temperatura ambiantă (18-25°C).

5.3.6. Se îndepărtează conjugatul de pe lamă. Se spală în conformitate cu cele indicate anterior (pct. 5.3.3). Se îndepărtează cu grijă excesul de tampon IF.

5.3.7. Se μlpetează 5-10 ui tampon glicerol fosfat 0,1 M (apendicele 4) sau o altă solutie antidecolorare de montare comercială în fiecare godeu si se acoperă cu o lamelă.

5.4. Citirea testului de imunofluorescentă

5.4.1. Se examinează lamele-test la un microscop cu sursă de lumină epifluorescentă si cu filtre adaptate pentru a lucra cu izotiocianat de fluoresceină, cu ulei de imersie sau în apă, la o mărire de 500-1.000. Se examinează godeurile pe două diametre în unghi drept si de-a lungul perimetrului. Pentru probele fără celule sau cu un număr redus de celule se examinează cel putin 40 câmpuri microscopice.

Se verifică mai întâi lama de control pozitiv. Celulele trebuie să fie intens fluorescente si colorate complet la titrul de anticorpi sau la dilutia de lucru determinată. Testul IF (pct. 5) trebuie repetat în cazul în care apare o coloratie anormală.

5.4.2. Se caută prezenta celulelor intens fluorescente cu morfologie caracteristică bacteriei Ralstonia solanacearum în godeurile lamelor-test (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensitatea fluorescentei trebuie să fie echivalentă cu cea a tulpinii de control pozitiv la aceeasi dilutie de anticorpi. Celulele cu coloratie incompletă sau cu fluorescentă slabă nu trebuie luate în considerare.

În cazul în care se suspectează o contaminare, testul trebuie repetat. Acest lucru se poate întâmpla atunci când în toate lamele unei serii de analize se observă celule pozitive din cauza unei contaminări a tamponului sau atunci când celulele pozitive se observă în afara godeurilor.

5.4.3. Există un anumit număr de probleme care afectează specificitatea testului de imunofluorescentă. La nivelul conurilor de tesut vascular si în bucătile de tulpini pot apărea populatii de celule fluorescente atipice din punct de vedere morfologic, precum si bacterii saprofite care pot conduce la reactii încrucisate, având mărime si morfologie asemănătoare cu Ralstonia solanacearum.

5.4.4. Trebuie luate în considerare numai celulele fluorescente ale căror dimensiune si morfologie sunt caracteristice titrului sau dilutiei de lucru a anticorpilor mentionati la pct. 5.3.

5.4.5. Interpretarea testului IF:

(i) în cazul în care se observă celule intens fluorescente cu morfologie caracteristică, se determină numărul mediu de celule tipice pe câmp microscopic si se calculează numărul de celule tipice pe ml de sediment resuspendat (apendice 5).

Testul de imunofluorescentă se consideră ca fiind pozitiv pentru probele care contin cel putin 5 x 103 celule tipice pe ml de sediment resuspendat. Proba se consideră ca fiind potential contaminată, fiind necesare mai multe testări, (ii) Testul de imunofluorescentă se consideră ca fiind negativ pentru probele care contin mai putin de 5 x 103 celule pe ml de sediment resuspendat. Proba se consideră ca fiind negativă, efectuarea altor teste nefiind obligatorie.

 

6. Testele PCR

Principii

în cazul în care testul PCR se foloseste drept test principal de detectie, iar rezultatul acestuia este pozitiv, trebuie efectuat un test de izolare sau un test de imunofluorescentă drept al doilea test de detectie obligatoriu. În cazul în care testul PCR se foloseste ca test secundar, iar rezultatul este pozitiv, diagnoza trebuie completată cu teste suplimentare, după cum indică diagrama functională.

O exploatare completă a acestei metode ca test principal de detectie se recomandă numai atunci când se dobândeste o expertiză specializată în domeniu.

 

notă: Testele preliminarii realizate în conformitate cu această metodă trebuie să permită detectia reproductibilă a 103-104 celule pe ml de Ralstonia solanacearum adăugate extractelor de probe care au dat anterior rezultate negative. Poate fi necesară efectuarea unor experimente de optimizare în toate laboratoarele pentru a obtine niveluri maxime de sensibilitate si de specificitate.

 

Se folosesc reactivi si protocoale PCR validate (vezi apendice 6). Se alege, de preferintă, o metodă care să contină un control intern.

Se iau măsurile de precautie necesare pentru a se evita contaminarea probei cu ADN-tintă. Testul PCR ar trebui realizat de tehnicieni experimentati în laboratoare de biologie moleculară specializate, pentru a se reduce cât mai mult posibilitatea contaminării cu ADN-tintă.

Controalele negative (pentru procedurile de extractie de ADN si amplificare PCR) ar trebui tratate întotdeauna ca probe finale în procedură, pentru a indica o eventuală aparitie a unui transfer de ADN.

Următoarele controale negative ar trebui incluse în testul PCR:

- extractul probei care a produs anterior rezultate negative pentru depistarea Ralstonia solanaceamm;

- tampoanele utilizate pentru extractia ADN din probă;

- amestecul de reactivi pentru PCR. Următoarele controale pozitive ar trebui incluse:

- alicote de sedimente resuspendate la care s-a adăugat Ralstonia solanacearum (preparare: vezi apendice 3 B);

- suspensie de 106 celule pe ml dintr-un izolat virulent de Ralstonia solanacearum în apă (de exemplu, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vezi apendice 3 B);

- atunci când este posibil, se foloseste, de asemenea, în testul PCR, ADN extras din probe pozitive în testul PCR.

Pentru a se evita o eventuală contaminare, controalele pozitive se prepară într-un mediu diferit de cel al probelor de testat.

Extractele probelor trebuie curătate, atât cât este posibil, de particulele de sol. În anumite cazuri, atunci când se prevede utilizarea protocoalelor PCR, ar putea fi recomandabil să se prepare extracte de tuberculi de cartofi spălati.

Materialele de control pozitiv si negativ standardizate, disponibile pentru utilizare în acest test, sunt prevăzute în apendicele 3.

6.1. Metode de purificare a ADN-ului

Se folosesc controale pozitive si negative în conformitate cu metoda descrisă anterior (vezi apendicele 3).

Controalele se testează în acelasi mod cu probele.

Există o serie de metode de purificare a ADN-tintă din substraturile de probe complexe, ce permit eliminarea inhibitorilor PCR si a altor reactii enzimatice si concentrează ADN-ul tintă din probă. Următoarea metodă a fost optimizată pentru utilizare în cadrul metodelor PCR validate indicate în apendicele 6.

a) Metoda Pastrik (2000)

(1) Se μlpetează 220 μl de tampon de liză [100 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] într-un tub Eppendorf de 1,5 ml.

(2) Se adaugă 100 μl de extract de probă si se introduce într-un bloc de încălzire sau în baie de apă la 95°C timp de 10 minute.

(3) Se asază tubul pe gheată timp de 5 minute.

(4) Se adaugă 80 ui de solutie concentrată de lizozim (50 mg de lizozim pe ml în 10 mM Tris-HCI, pH 8,0) si se incubează la 37°C timp de 30 de minute.

(5) Se adaugă 220 μl de solutie A de Easy DNA® (Invitrogen), se amestecă bine prin vortexare si se incubează la 65°C timp de 30 de minute.

(6) Se adaugă 100 μl de solutie B de Easy DNA® (Invitrogen), se omogenizează bine prin vortexare până când precipitatul circulă liber în tub, iar proba are o consistentă uniform-vâscoasă.

(7) Se adaugă 500 μl de cloroform si se omogenizează prin vortexare până când vâscozitatea este redusă si amestecul este omogeiL

(8) Se centrifughează la 15.000 g timp de 20 de minute la 4°C pentru a separa fazele si a forma interfaza.

(9) Faza superioară se transferă într-un nou tub Eppendorf.

(10) Se adaugă 1 ml de etanol 100 % (- 20°C), se omogenizează scurt prin vortexare si se incubează pe gheată timp de 10 minute.

(11) Se centrifughează la 15.000 g timp de 20 de minute la 4°C si se îndepărtează etanolul din extractul concentrat.

(12) Se adaugă 500 μl de etanol 80 % (- 20°C) si se amestecă prin răsturnare.

(13) Se centrifughează la 15.000 g timp de 10 minute la 4°C, se păstrează sedimentul si se îndepărtează etanolul.

(14) Sedimentul se lasă să se usuce în aer liber sau într-un SpeedVacADN.

(15) Sedimentul se repune în suspensie în 100 μl de apă ultrapură sterilă si se lasă la temperatura ambiantă timp de cel putin 20 de minute.

(16) Se depozitează la - 20°C până când extractul este necesar pentru PCR.

(17) Înainte de utilizare se centrifughează, pentru reactia de amplificare prin PCR fiind necesari 5 μl de supernatant continând ADN.

b) Alte metode

Pot fi utilizate si alte metode de extractie a ADN, de exemplu Qiagen DNeasy Plant Kit, cu conditia ca acestea să aibă o eficacitate echivalentă de purificare a ADN-ului din controalele pozitive cu un continut de 103-104 celule patogene per ml.

6.2. Amplificare PCR

6.2.1. Se pregătesc extractele de ADN de testat si controalele în conformitate cu protocoalele validate (pct. 6). Se prepară o dilutie decimală din extractul de probă de ADN (1:10 în apă ultrapură).

6.2.2. Se prepară amestecul reactiv (mixul de amplificare) corespunzător pentru PCR într-un mediu necontaminat în conformitate cu protocoalele publicate (apendice 6). În cazul în care este posibil, se recomandă utilizarea unui protocol PCR multiplex care include un control intern al reactiei PCR.

6.2.3. Se adaugă 2-5 μl de extract de ADN pe 25 μl mix PCR în tuburi PCR sterile în conformitate cu protocoalele PCR (vezi apendicele 6).

6.2.4. Se include un control negativ continând numai mix de amplificare si se adaugă apă ultrapură, din aceeasi sursă cu cea utilizată pentru mixul de amplificare PCR, în locul probei.

6.2.5. Tuburile se introduc în acelasi termociclor utilizat la testul preliminar si se lansează programul PCR optimizat în mod corespunzător (apendice 6).

6.3. Analiza produsului reactiei PCR (amplicon)

6.3.1. Fragmentele PCR sunt detectate prin electroforeză în gel de agaroză. Se pune sub tensiune la 5-8 V/cm o cantitate de cel putin 12 μl de ADN amplificat din fiecare probă la care se adaugă 3 μl de tampon de încărcare (apendice 6) în gel de agaroză 2 % într-un tampon tris-acetat-EDTA (TAE) (vezi apendicele 6). Se foloseste un marker de ADN corespunzător mărimii asteptate a ampliconului, precum cel de 100 bp.

6.3.2. Pentru vizualizarea fragmentelor de ADN, se recurge la colorare cu bromură de etidiu (10,5 mg/l) timp de 30-60 de minute, luându-se măsurile de precautie necesare pentru manipularea acestui agent mutagen.

6.3.3. În cazul unor produse PCR având mărimea asteptată (vezi apendicele 6), gelul colorat se vizualizează prin iluminare ultravioletă cu unde scurte (A = 302 nm) si se notează rezultatele.

6.3.4. Pentru noile cazuri sau constatări, se verifică autenticitatea fragmentului amplificat PCR, efectuându-se o analiză de restrictie enzimatică pe o probă de ADN amplificată rămasă. În acest scop, ADN-ul amplificat rămas se incubează la o temperatură optimă si pe o perioadă optimă cu o enzimă si un tampon corespunzător (vezi apendicele 6). Fragmentele restrictate se detectează prin electroforeză în gel de agaroză si colorare cu bromură de etidiu în conformitate cu metoda descrisă anterior. Dispunerea tipică a fragmentelor după analiza de restrictie enzimatică se vizualizează prin iluminare ultravioletă. Fragmentele de ADN se compară cu tulpinile de control pozitiv înainte si după restrictie.

Interpretarea rezultatului testului PCR

Testul PCR este negativ atunci când produsul PCR specific pentru Ralstonia solanacearum cu dimensiunea asteptată nu este detectat pentru proba respectivă, iar pentru ansamblul de probe, în cazul unui multiplex PCR cu primeri de control intern specific plantei, un al doilea produs PCR cu dimensiunea asteptată trebuie să fie amplificat cu probele respective.

Testul PCR este pozitiv în cazul în care produsul PCR caracteristic de Ralstonia solanacearum de dimensiunea si tipul de restrictie (atunci când este restrictat) asteptate este detectat, cu conditia să nu existe amplificare la probele de control negativ. Se poate obtine o confirmare fiabilă a rezultatului pozitiv prin repetarea testului cu un al doilea set de primeri PCR (apendicele 6).

 

NOTĂ: Se poate suspecta o inhibitie a PCR în cazul în care fragmentul amplificat prevăzut este obtinut în cazul controlului pozitiv de Ralstonia solanacearum în apă, dar se obtin rezultate negative în cazul controalelor pozitive continând R. solanacearum în extractul de cartof. In protocoalele PCR compuse, cu control intern al PCR, se constată inhibitia reactiei atunci când nu se obtine niciunul dintre cele două fragmente amplificate.

Se poate suspecta o contaminare atunci când fragmentul amplificat prevăzut este obtinut din unul sau mai multe controale negative.

 

7. Testul FISH

Principiu

în cazul în care testul FISH se foloseste drept test principal de detectie si rezultatul lui este pozitiv, trebuie efectuat un test de izolare sau un test IF drept al doilea test obligatoriu de detectie. În cazul în care testul IF se foloseste ca test secundar si rezultatul lui este pozitiv, analiza trebuie completată cu teste suplimentare, după cum indică diagrama functională.

 

NOTĂ: Se folosesc oligosonde validate specifice pentru Ralstonia solanacearum (a se vedea apendicele 7). Testele preliminare efectuate în conformitate cu această metodă trebuie să permită o detectie reproductibilă de 10M04 celule pe ml de Ralstonia solanacearum adăugate la extractele de probe care au dat anterior rezultate negative.

Este de preferat să se aplice procedura descrisă în continuare extractelor de probe proaspăt preparate, dar se pot folosi si extracte de probe conservate la temperaturi cuprinse între -16°C si - 24°C sau între - 68°C si - 86°C.

Drept control negativ, se folosesc alicote de extracte de probe care au dat anterior rezultate negative la testele de identificare a Ralstonia solanacearum.

Drept control pozitiv, se folosesc suspensii continând 105-106 celule pe ml de Ralstonia solanacearum biovar 2 (de exemplu, tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; a se vedea apendicele 3) preparate în tampon fosfat 0,01 M (PB), dintr-o cultură de 3-5 zile. Separat, se prepară lame de control pozitiv din tulpina omologă sau din orice altă tulpină de referintă de Ralstonia solanacearum, în suspensie în extract de cartof, în conformitate cu apendicele 3 B.

Controlul procesului de hibridizare se realizează prin utilizarea unei oligosonde eubacteriene marcate cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) care colorează toate eubacteriile prezente în probă.

Materialele de control pozitiv si negativ standardizate disponibile pentru acest test sunt prevăzute în apendicele 3 A.

Materialul de control se testează în acelasi mod ca si probele.

7.1. Fixarea extractului de cartof

Protocolul descris în continuare se bazează pe Wullings ef al. (1998):

7.1.1. Se prepară solutia de fixare (a se vedea apendicele 7).

7.1.2. Se μlpetează 100 μl din fiecare extract de probă într-un tub Eppendorf si se centrifughează timp de 7 minute la 7.000 g.

7.1.3. Se îndepărtează supernatantul, iar sedimentul se resuspendă în 200 μl de solutie de fixare preparată cu mai putin de 24 de ore înainte. Se omogenizează prin vortexare si se incubează timp de o oră în frigider.

7.1.4. Se centrifughează timp de 7 minute la 7.000 g, se îndepărtează supranatantul, iar sedimentul se resuspendă în 75 μl de PB 0,01 M (a se vedea apendicele 7).

7.1.5. Se μlpetează 16 μl din suspensiile fixate pe o lamă multitest curată, în conformitate cu figura 7.1. Pe fiecare lamă se μlpetează două probe diferite, nediluate, si 10 μl dilutie de 1:100 ale acestora (într-un tampon fosfat 0,01 M). Restul suspensiei (49 μl) poate fi conservată la - 20°C după ce i s-a adăugat un volum de etanol de 96 %. În cazul în care testul FISH trebuie repetat, se elimină etanolul prin centrifugare si se adaugă un volum echivalent de tampon fosfat 0,01 M (omogenizati prin vortexare).

 

Figura 7.1. Configuratia unei lame pentru testul FISH

 

Proba 1

martor

martor

martor

Proba 2

o

o

o

o

o

godeu 1

godeu 2

godeu 3

godeu 4

godeu 5

Proba 1

martor

martor

martor

Proba 2

o

o

o

o

o

Godeu 6

godeu 7

godeu 8

godeu 9

godeu 10

 

Lamela 1

 

 

Lamela 2

 

 

7.1.6. Se usucă lamele la temperatura ambiantă (sau într-un uscător, la 37"C), apoi se fixează prin flambare.

Procedura de hibridizare poate fi întreruptă în acest stadiu si continuată a doua zi. Lamele trebuie păstrate într-un loc uscat, la temperatura ambiantă, ferite de praf.

7.2. Hibridizare

7.2.1. Se deshidratează celulele prin băi succesive de etanol de 50 %, 80 % si 96 %, cu o durată de un minut fiecare. Se aranjează lamele pe un suport si se lasă la uscat la temperatura ambiantă.

7.2.2. Se realizează o cameră de incubare umedă căptusind fundul unei cutii ermetice cu hârtie absorbantă sau cu hârtie de filtru impregnată cu hibmix 1X (a se vedea apendicele 7). Cutia se preincubează timp de cel putin 10 minute în incubatorul de hibridizare la o temperatură de 45°C.

7.2.3. Se μlpetează 10 μl de solutie de hibridizare (apendicele 7) în 8 godeuri (godeuri 1,2,4, 5, 6, 7, 9 si 10; vezi figura 7.1) ale fiecărei lame, lăsând goale cele două godeuri din mijloc (3 si 8).

7.2.4. Se acoperă cu lamele (24 x 24 mm) primul si ultimele 4 godeuri, având grijă să nu prindă aer sub ele. Lamele se introduc în camera umedă încălzită în prealabil si se lasă timp de 5 ore în incubator la 45°C la întuneric, pentru hibridizare.

7.2.5. Se pregătesc 3 recipiente continând 1 I de apă Milli Q (biologie moleculară), 1 I de hibmix 1X în 334 ml de hibmix 3X si 666 ml de apă Milli Q (biologie moleculară) si1 I de hibmix 1/8X în 42 ml de hibmix 3X si 958 ml de apă Milli Q (biologie moleculară). Se preincubează fiecare recipient în baie de apă la 45°C.

7.2.6. Se îndepărtează lamelele de pe lame si se asază pe un suport de lame.

7.2.7. Se elimină excesul de probă prin incubare timp de 15 minute la 45°C în recipientul cu hibmix 1X.

7.Z8. Se transferă suportul cu lame într-o solutie de spălare cu hibmix 1/8X si se lasă la incubat timp de încă 15 minute.

7.2.9. Lamele se introduc scurt într-o baie de apă Milli Q si se asază pe o hârtie de filtru. Se îndepărtează umiditatea în exces tamponând usor suprafata umedă cu hârtie de filtru. Se μlpeteazăîn fiecare godeu 5-10 μl de solutie antidecolorare (de exemplu, Vectashield produs de Vecta Laboratories CA, USA, sau altă solutie echivalentă) si se acoperă întreaga suprafată a lamei cu o lamelă (24 x 60 mm).

7.3. Citirea testului FISH

7.3.1. Lamele se examinează imediat cu ajutorul unui microscop cu epifluorescentă, cu obiectivul de imersie, în ulei de imersie la o mărire de 630 x 1.000. Cu un filtru sensibil la izotiocianat de fluoresceină (FITC), celulele eubacteriene prezente în probe (inclusiv majoritatea celulelor Gram-negative) apar colorate în verde fluorescent. Cu un filtru adaptat la tetrametil-rodamin-5-izotiocianat, celulele de Ralstonia solanacearum marcate cu Cy3 apar colorate în rosu fluorescent. Se compară morfologia celulelor din probe cu cea a celulelor din controlul pozitiv. Celulele trebuie să fie colorate complet si intens fluorescente. Testul FISH (pct. 7) trebuie repetat în cazul în care apare o coloratie anormală. Godeurile se examinează de-a lungul a două diametre perpendiculare si în jurul perimetrului. Pentru probele care nu contin celule sau contin un număr mic de celule, se examinează cel putin 40 de câmpuri microscopice.

7.3.2. Se observă prezenta celulelor intens fluorescente, cu o morfologie tipică de Ralstonia solanacearum în ferestrele de test ale lamelor (vezi website-ul  http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensitatea fluorescentei trebuie să fie echivalentă cu cea a tulpinii de control pozitiv sau mai bună. Celulele cu coloratie incompletă sau cu fluorescentă slabă nu trebuie luate în considerare.

7.3.3. La cea mai mică suspiciune de contaminare, testul trebuie repetat. Aceasta se poate întâmpla atunci când în toate lamele unei serii de analize se observă celule pozitive din cauza contaminării tamponului sau atunci când celulele pozitive se observă în afara godeurilor.

7.3.4. Există un anumit număr de probleme inerente care afectează specificitatea testului FISH. La nivelul conurilor de tesut vascular si tulpinii pot apare populatii de celule fluorescente cu morfologie atipică si populatii de bacterii saprofite care dau reactii încrucisate, având dimensiuni si morfologii asemănătoare cu celulele de Ralstonia solanacearum, însă într-o proportie mult mai mică decât în cazul testului IF.

7.3.5. Se iau în considerare numai celulele fluorescente cu dimensiune si morfologie tipice.

7.3.6. Interpretarea rezultatului testului FISH:

(i) Testul FISH este valid atunci când celulele intens fluorescente de culoare verde, cu dimensiuni si morfologie tipice pentru Ralstonia solanacearum, sunt vizibile cu ajutorul filtrului FITC si celulele intens fluorescente de culoare rosie sunt vizibile folosindu-se filtrul cu rodamină în toate controalele pozitive, iar în controlul negativ nu se observă nicio celulă. În cazul în care proba contine celule intens fluorescente, cu o morfologie tipică, se estimează numărul mediu de celule tipice pe câmp microscopic si se calculează numărul de celule tipice pe ml de sediment resuspendat (apendice 4).

Probele ce contin cel putin 5 x 103 celule tipice pe ml de sediment resuspendat se consideră ca fiind potential infectate si se recomandă continuarea testelor. Probele ce contin mai putin de 5 x 103 celule tipice pe ml de sediment resuspendat sunt considerate ca fiind negative, (ii) Testul FISH este negativ în cazul în care celulele intens fluorescente de culoare rosie, având dimensiuni si morfologie caracteristice pentru Ralstonia solanacearum, nu se observă cu ajutorul filtrului cu rodamină, cu conditia ca celulele intens fluorescente de culoare rosie să fie vizibile în lamele de control pozitiv folosindu-se filtrul cu rodamină.

 

8. Testele ELISA

Principiu

Testul ELISA nu poate fi utilizat ca test secundar pe lângă testele IF, PCR sau FISH din cauza sensibilitătii sale relativ slabe. În cazul aplicării metodei DAS-ELISA, îmbogătirea probelor si utilizarea anticorpilor monoclonali sunt obligatorii (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). îmbogătirea probelor înainte de efectuarea testului ELISA poate fi utilă pentru cresterea sensibilitătii acestuia, dar poate să inhibe testul din cauza competitiei cu alte organisme prezente în probă.

notă.- Se foloseste o sursă validată de anticorpi de Ralstonia solanacearum (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Se recomandă să se determine titrul pentru fiecare lot nou de anticorpi. Titrul se defineste ca fiind cea mai mare dilutie la care se obtine o reactie optimă atunci când se testează o suspensie de 105-106 celule pe ml din tulpina omologă de Ralstonia solanacearum folosindu-se conjugate corespunzătoare de anticorpi secundari, în conformitate cu recomandările producătorului. La efectuarea testului, dilutia de lucru a anticorpilor trebuie să fie aproximativ egală sau egală cu cea a titrului formulei comerciale.

Se determină titrul anticorpilor pentru o suspensie de 105-106 celule/ml dintr-o tulpină omologă de Ralstonia solanacearum.

Drept controale negative se utilizează un extract de probă care a dat anterior rezultate negative pentru Ralstonia solanacearum si o suspensie bacteriană preparată în tampon fosfat care nu provoacă reactii încrucisate

Drept control pozitiv se folosesc extracte de probe care au dat anterior rezultate negative, la care s-a adăugat 103-104 celule/ml de biovar 2 de Ralstonia solanacearum (de exemplu, tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vezi apendicii 2 A si B). Pentru a compara rezultatele din fiecare placă se foloseste o suspensie standard de 105-106 celule/ml în PBS de Ralstonia solanacearum. Controalele pozitive trebuie să fie μlpetate cu grijă pe placa de microtitrare, separat de proba sau probele care fac obiectul testului.

Materialele de control pozitiv si negativ standardizate, disponibile pentru utilizare în acest test, sunt enumerate în apendicele 3 A.

Materialul de control se testează în acelasi mod cu probele.

Au fost validate două protocoale ELISA:

a) ELISA indirect (Robinsdn-Smith etal., 1995)

(1) Se folosesc alicote de 100-200 μl de sediment resuspendat. (Pentru a reduce rezultatele nespecifice se încălzesc timp de 4 minute la 100°C pe baie de apă sau într-un bloc de încălzire.)

(2) Se adaugă un volum egal de tampon 2X (apendicele 4) si se omogenizează prin vortexare.

(3) Se μlpetează alicote de 100 μl de extract în cel putin două godeuri ale plăcii de microtitrare (de exemplu, Nunc-Polysorp sau echivalent) si se incubează o oră la 37°C sau peste noapte la 4°C.

(4) Se îndepărtează extractele din godeuri. Se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (apendicele 4), lăsând ultima solutie de spălare în godeuri cel putin 5 minute.

(5) Se prepară dilutia corespunzătoare a antiserului anti-Ralstonia solanacearum în tampon de saturatie (apendicele 4). Pentru anticorpii comerciali validati, se folosesc dilutiile recomandate (de obicei, de două ori mai concentrate decât titrul).

(6) Se μlpeteazălOO μl în fiecare godeu si se incubează o oră la 37°C.

(7) Se îndepărtează solutia de anticorpi din godeuri si se spală în conformitate cu cele indicate anterior [pct. (4)].

(8) Se prepară dilutia corespunzătoare de conjugat secundar de anticorpi si de fosfatază alcalină în tampon de saturatie Se μlpeteazălOO μl în fiecare godeu si se incubează o oră la 37°C.

(9) Se îndepărtează conjugatul de anticorpi din godeuri si se spală în conformitate cu cele indicate anterior [pct. (4)].

(10) Se μlpetează 100 μl de solutie de substrat de fosfatază alcalină (apendicele 4) în fiecare godeu. Se incubează în întuneric la temperatura ambiantă si se măsoară absorbanta la 405 nm la intervale regulate în termen de 90 de minute.

b) DAS-ELISA

(1) Se prepară dilutia corespunzătoare de imunoglobuline policlonale anti-Ra/ston/a solanacearum în tampon concentrat cu pH 9,6 (apendicele 4). Se adaugă 200 μl în fiecare godeu. Se incubează timp de 4-5 ore la 37°C sau timp de 16 ore la 4°C.

(2) Se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (apendicele 4). Se adaugă 190 μl de extract de probă în cel putin două

godeuri. De asemenea, se adaugă controlul pozitiv si negativ în cât& două godeuri pe fiecare placă. Se incubează timp de 16 ore la 4°C.

(3) Se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (apendicele 4).

(4) Se prepară o dilutie corespunzătoare de anticorpi monoclonali specifici Ralstonia solanacearum în PBS (apendicele 4) continând, de asemenea, 0,5 % seralbumină bovină (BSA) si se μlpetează 190 μl în fiecare godeu. Se incubează două ore la 37°C.

(5) Se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (apendicele 4).

(6) Se prepară o dilutie corespunzătoare de imunoglobuline antisoarece conjugate cu fosfatază alcalină în PBS. Se adaugă 190 μl în fiecare godeu. Se incubează două ore la 37°C.

(7) Se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (apendicele 4).

(8) Se prepară o solutie de substrat de fosfatază alcalină continând 1 mg de p-nitrofenil fosfat pe ml de solutie tampon (apendicele 4). Se adaugă 200 μl în fiecare godeu. Se incubează la întuneric la temperatura ambiantă si se măsoară absorbanta la 40 nm la intervale regulate în termen de 90 de minute.

Interpretarea rezultatelor testelor ELISA

Testul ELISA este negativ atunci când densitatea optică (DO) medie a godeurilor probei duplicate este mai mică decât de două ori densitatea optică a godeurilor controlului negativ, cu conditia ca densitatea optică a controlului pozitiv să fie întotdeauna mai mare de 1,0 (după 90 de minute de incubare cu substratul) si de două ori mai mare decât densitatea optică obtinută pentru controlul negativ.

Testul ELISA este pozitiv atunci când densitatea optică (DO) medie a godeurilor probei duplicate este mai mare decât de două ori densitatea optică a godeurilor controlului negativ, cu conditia ca DO pentru toate godeurile de control negativ să fie mai mică decât de două ori DO obtinută pentru godeurile de control pozitiv.

O citire negativă a testului ELISA în godeurile de control pozitiv indică faptul că testul nu a fost efectuat corect sau că a fost inhibat O citire pozitivă a testului ELISA în godeurile de control negativ indică o contaminare încrucisată sau o reactie nespecifică.

 

9. Testul biologic

 

NOTĂ: Testele preliminare efectuate în conformitate cu această metodă trebuie să permită o detectie reproductibilă a 103-10* celule formatoare de colonii (UFC) per ml de Ralstonia solanacearum adăugate la extractele de probe care au dat anterior rezultate negative (preparare: vezi apendice 3).

Sensibilitatea cea mai mare de detectie poate fi atinsă atunci când se folosesc extracte de probe proaspăt preparate si în conditii optime de crestere. Cu toate acestea, metoda se poate aplica cu succes extractelor păstrate în glicerol la o temperatură cuprinsă între - 68 si - 86°C.

 

Următorul protocol se bazează pe protocolul Janse (1988):

9.1. Pentru fiecare probă se utilizează 10 plante-test ale unui soi (cultivar) de tomate sensibil (de exemplu, Moneymaker sau un cultivar cu o sensibilitate echivalentă stabilită în laboratorul de testare) în stadiul celei de-a treia frunze adevărate. Pentru detalii privind cultura, vezi apendicele 8. De asemenea, se pot utiliza vinete (de exemplu, Black Beauty sau cultivări cu o sensibilitate echivalentă), folosindu-se numai plante în stadiul celei de-a doua sau a treia frunze până la dezvoltarea completă a celei de-a treia frunze adevărate. Cu toate acestea, s-a constatat că la plantele de vinete simptomele sunt mai putin severe si se dezvoltă mai încet. Prin urmare, atunci când este posibil, se recomandă utilizarea plantulelor de tomate.

9.2. Se inoculează100 μl de extract în fiecare plantă-test.

9.2.1. Inoculare prin injectare

Plantele-test se inoculează în tulpină chiar deasupra cotiledoanelor cu ajutorul unei seringi cu ac hipodermic (minimum 23G).

9.2.2. Inoculare prin incizie

Se tine planta între două degete si se μlpetează pe tulpină, între cotiledoane si prima frunză, o μlcătură (circa 5-10 μl) de extract de probă.

Cu ajutorul unui bisturiu steril, plecând de la μlcătura de extract, se face o incizie diagonală pe o lungime de 1 cm si cu o adâncime egală cu aproximativ două treimi din grosimea tulpinii.

Se închide incizia aplicând vaselină sterilă cu ajutorul unei seringi.

9.3. Prin aceeasi tehnică se inoculează 5 plantule cu o suspensie apoasă de 105-106 celule per ml dintr-o cultură virulentă de 48 de ore de Ralstonia solanacearum biovar 2 drept control pozitiv si 5 plantule cu tampon fosfat (apendice 4) drept control negativ. Se separă plantele control pozitiv si negativ de celelalte plante pentru a se evita contaminările încrucisate.

9.4. Plantele test se cresc în încăperi de carantină până la 4 săptămâni la temperatura de 25-30°C si umiditate relativ mare, stropindu-le în mod corespunzător pentru a preveni o suprasaturare hidrică sau ofilirea din lipsă de apă. Pentru a se evita contaminarea, plantele control pozitiv si negativ se incubează separat în standuri separate în mod corespunzător într-o seră ori cameră de cultivare sau, în cazul în care spatiul este limitat, se asigură o separare strictă între metodele de tratare. Atunci când plantele apartinând unor probe diferite trebuie incubate în apropiere unele de celelalte, trebuie prevăzute între ele ecrane de separare corespunzătoare. În timpul fertilizării, stropirii, controlului sau oricărei alte manipulări, trebuie luate toate măsurile de precautie pentru a se evita o contaminare încrucisată. Este esential ca în serele si camerele de cultivare să nu fie insecte, dat fiind faptul că acestea ar putea transmite bacteria de la o probă la alta.

Se observă aparitia simptomelor de ofilire: epinastie, cloroză si/sau μlpernicire.

9.5. Se izolează plantele infectate si se identifică culturile purificate prezumtive (suspecte) de Ralstonia solanacearum (Ut. B). _

9.6. În cazul în care nu se observă niciun simptom după 3 săptămâni, se efectuează un test IF/PCR/de izolare pe o probă formată din bucăti de tulpină de 1 cm prelevate de la fiecare plantă-test chiar deasupra punctului de inoculare. În cazul în care testul este pozitiv, se efectuează însământarea pe mediu de cultură (pct. 4.1).

9.7. Se identifică toate culturile purificate prezumtive de Ralstonia solanacearum (lit. B).

Interpretarea rezultatelor testului biologic:

Rezultatele testului biologic sunt valide atunci când plantele control pozitiv prezintă simptome tipice, bacteriile pot fi reizolate din aceste plante si nu se observă niciun simptom la plantele control negativ.

Testul biologic este negativ în cazul în care plantele-test inoculate cu extract de probă nu sunt infectate cu Ralstonia solanacearum si cu conditia ca Ralstonia solanacearum să fie detectată în plantele control pozitiv.

Testul biologic este pozitiv dacă plantele-test sunt infectate cu Ralstonia solanacearum.

 

B. TESTE DE IDENTIFICARE

Culturile pure prezumtive de Ralstonia solanacearum se identifică prin cel putin unul dintre următoarele teste bazate pe principii biologice diferite.

Se includ, după caz, tulpini de referintă cunoscute, pentru fiecare test efectuat (vezi apendicele 3).

1. Teste de identificare enzimatice si de nutritie

 

Se stabilesc următoarele caracteristici fenotipice prezente sau absente sistematic la Ralstonia solanacearum, în conformitate cu metodele descrise de Lelliott si Stead (1987), Klement et al. (1990) si Schaad (2001).

 

Test

Rezultat preconizat

Productia de μlgmenti fluorescenti

-

Incluziuni de poli-lt-hidroxibutirat

+

Test de oxidare/fermentare (O/F)

O+/F-

Activitatea catalazei

+

Testul oxidazei de Kovac

+

Reducerea nitratului

+

Utilizarea citratului

+

Crestere la 40°C

-

Crestere în 1 % NaCl

+

Crestere în 2 % NaCl

-

Activitatea arginin dihidrolazei

-

Lichefierea gelatinei

-

Hidroliza amidonului

-

Hidroliza esculinei

-

Productie de levan

-

 

2. Testul IF

2.1. Se prepară o suspensie de circa 106 celule/ml în tampon IF (apendice 4).

2.2. Se prepară o serie de dilutii de 1/2 dintr-un antiser corespunzător (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3. Se aplică procedura testului IF (lit ApcL 5).

2.4. Pentru ca un test IF să fie pozitiv, titrul obtinut pentru cultură trebuie să fie echivalent cu cel al controlului pozitiv.

3. Testul ELISA

 

notă:  În cazul în care se efectuează numai două teste de identificare, nu se efectuează alte teste serologice pe lângă această metodă.

3.1. Se prepară o suspensie de circa 108 celule/ml în PBS 1X (vezi apendicele 4).

3.2. Se aplică procedura ELISA corespunzătoare cu un anticorp monoclonal specific de Ralstonia solanacearum.

3.3. Un test ELISA este pozitiv atunci când densitatea optică a culturii este egală cel putin cu % din densitatea optică obtinută pentru controlul pozitiv.

4. Testul reactiei de polimerizare în lant (PCR)

4.1. Se prepară o suspensie de circa 106 celule/ml în apă sterilă ultrapură.

4.2. Se μlpetează 100 ui din suspensie în tuburi închise si se pun într-un bloc de încălzire sau pe baie de apă la 100°C timp de 4 minute. Apoi probele pot fi păstrate la o temperatură situată între - 16 si - 24°C până în momentul în care sunt utilizate în următoarele etape ale testului PCR.

4.3. Se aplică protocoalele PCR corespunzătoare pentru amplificarea fragmentelor tipice de Ralstonia solanacearum vezi, de exemplu, Seal et al. (1993), Pastrik & Maiss (2000), Pastrikef al. (2002), Boudazin etal. (1999), Opina etal. (1997), Wellerefa/. (1999).

4.4. O identificare pozitivă a bacteriei Ralstonia solanacearum seobtine atunci când fragmentele amplificate prin PCR au aceeasi dimensiune si aceleasi polimorfisme ale dimensiunii fragmentelor de restrictie cu cele ale tulpinii de control pozitiv.

5. Testul de hibridizare fluorescentă in situ (FISH)

5.1. Se prepară o suspensie de circa 10tcelule/ml în apă ultrapură.

5.2. Se aplică procedura FISH (lit. A pct. 7) folosindu-se cel putin două oligosonde specifice pentru Ralstonia solanaceamm (apendice 7).

5.3. Pentru ca un test FISH să fie pozitiv, cultura trebuie să prezinte aceleasi reactii ca si controlul pozitiv.

6. Profilul acizilor grasi (FAP)

6.1. Se realizează o cultură de 48 de ore (28°C) pe mediu tripticaz-soia-agar (Oxoid).

6.2. Se aplică procedura FAP corespunzătoare (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3. Pentru ca un test FAP să fie pozitiv, profilul culturii prezumtive trebuie să fie identic cu cel al controlului pozitiv. Prezenta acizilor grasi caracteristici 14:0 30H, 16:0 20H, 16:1 20H si 18:1 20H si absenta16:0 30H indică prezenta Ralstonia sp.

7. Metode de caracterizare a tulpinii

Se recomandă o caracterizare a tulpinii prin una dintre următoarele metode pentru fiecare caz nou de izolare a bacteriei Ralstonia solanaceamm.

Se includ, după caz, tulpini de referintă cunoscute pentru fiecare test efectuat (vezi apendicele 3).

7.1. Determinarea biovarului

Există diferite biovaruri de Ralstonia solanaceamm în functie de capacitatea lor de a utiliza si/sau oxida 3 zaharuri si 3 hexoze alcoolice (Hayward, 1964 si Hayward et al., 1990). Mediile de crestere pentru testul biovarului sunt descrise în apendicele 2. Testul poate fi realizat inoculând prin injectare profundă a mediilor cu culturi pure de izolat de Ralstonia solanaceamm si incubare la 28°C. În cazul în care mediile sunt repartizate pe plăci de cultură cu 96 de godeuri sterile (200 ul/godeu), se poate observa o modificare a culorii, în 72 de ore, din verde-oliv în galben, ceea ce indică un rezultat pozitiv al testului.

 

 

 

Biovar

 

 

 

 

1

2

3

4

5

Utilizarea:

 

 

 

 

 

Maltozei

Lactozei D (+)

Celobiozei

Manitolului

Sorbitolului

Dulcitolului

-

-

-

-

-

-

+

+
+

-

-

-

+

+

+

+

+

+

-

-

-

+

+

+

+

+

+

+

-

-

Teste suplimentare diferentiază biovarul 2 în subfenotipuri:

 

 

 

 

Biovar 2A

(răspândit în lume)

Biovar 2A (găsit în Chile si în Columbia)

Biovar 2T

(găsit în zona tropicală)

Utilizarea trehatozet

Utilizarea mezo-inozitei

Utilizarea D-ribozei

Activitate pectolitică1

-

+

-

scăzută

+

-

-

scăzută

+

+

+

ridicată

1) Vezi Lelliott & Stead (1987)

 

7.2. Amprentare genomică

Diferentierea moleculară a tulpinilor din complexul Ralstonia solanacearum se poate face prin:

7.2.1. analiza polimorfismului dimensiunii fragmentelor de restrictie (RFLP) (Cook et al., 1989);

7.2.2. PCR realizat pe secvente repetitive folosindu-se primeri REP, BOX si ERIC (Louws et al, 1995; Smith ef al, 1995);

7.2.3. analiza polimorfismului dimensiunii fragmentelor de restrictie amplificate (Van der Wolf ef al., 1998).

7.3". metodele PCR.

Se pot folosi primeri specifici PCR (Pastrik et al., 2002; vezi apendice 6) pentru a diferentia tulpinile apartinând diviziunii 1 (biovari 3,4 si 5) si diviziunii 2 (biovari 1, 2A si 2T) ale Ralstonia solanacearum, definite initial de analiza RFLP (Cook ef al., 1989) si analiza secventei 16S a ADNr (Taghavi et al., 1996).

 

C. TEST DE CONFIRMARE

Testul de patogenitate trebuie efectuat pentru confirmarea finală a diagnosticului si pentru evaluarea virulentei culturilor identificate ca fiind Ralstonia solanacearum.

(1) Se prepară un inoculum de circa 106 celule/ml dintr-o cultură de 24-48 de ore dintr-o tulpină corespunzătoare de control pozitiv de Ralstonia solanacearum (de exemplu, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vezi apendicele 3).

(2) Se inoculează 5-10 plantule de tomate sau vinete sensibile, în stadiul celei de a treia frunze adevărate (vezi lit. A pct. 9).

(3) Se incubează până la două săptămâni la 25-28°C si umiditate relativă crescută, asigurând o stropire corespunzătoare pentru a preveni suprasaturarea hidrică sau stresul de deshidratare. În cazul culturilor pure, în 15 zile ar trebui să intervină ofilirea. În absenta simptomelor la-sfârsitul acestei perioade, cultura nu poate fi confirmată ca fiind o formă patogenă de Ralstonia solanacearum.

(4) Se observă aparitia simptomelor de ofilire si/sau epinastie, cloroză si de μlpernicire.

(5) Se izolează plantele simptomatice îndepărtând o sectiune de tesut din tulpină la 2 cm deasupra punctului de inoculare. Se mărunteste si se suspendă într-un volum mic de apă distilată sterilă sau tampon fosfat de 50 mM (apendice 4). Se însământează suspensia pe un mediu adecvat, de preferintă mediu selectiv (apendice 2), se incubează timp de 48-72 de ore la 28°C si se observă formarea coloniilor tipice de Ralstonia solanacearum.

 

Apendicele 1

 

Laboratoarele care efectuează optimizarea si validarea protocoalelor

 

 

 

Laborator1)

Oras

Tara

Agentur fur Gesundheit und Emahrungssicherheit

Viena si Linz

Austria

Departament Gewasbescherming

Merelbeke

Belgia

Plantedirektoratet

Lyngby

Danemarca

Central Science Laboratory

York

Anglia

Scottish Agricultural Science Agency

Edinburgh

Scotia

Laboratoire national de la protection des vegetaux,

Angers

Franta

Unite de Bacteriologie

 

 

Laboratoire national de la protection des vegetaux,

Le Rheu

Franta

Station de quarantine de la pomme de terre

 

 

Biologische Bundesanstalt

Kleinmachnow

Germania

Pflanzenschutzamt Hannover

Hanovra

Germania

State Laboratory

Dublin

Irlanda

Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali

Bologna

Italia

Regione Veneto Unita Periferica per i Servizi Fitosanitari

Verona

Italia

Nederlandse Algemene Keuringesdienst

Plantenziektenkundige Dienst

Direccao-Geral de Proteccao das Culturas

Centro de Diagnostico de Aldearrubia

Institute Valenciano de Investigaciones Agrarias

Swedish University of Agricultural Sciences

Emmeloord

Wageningen

Lisabona

Salamanca

Valencia

Uppsala

Tările de Jos

Tările de Jos

Portugalia

Spania

Spania

Suedia

 

1) Experti de contact: vezi http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main .

 

 

Apendicele 2

 

Medii pentru izolarea si cultivarea bacteriei Ralstonia solanacearum

 

a) Medii de crestere în general

Agar nutritiv (AN)

Agar nutritiv (Difco) 23,0 g

Apă distilată 1,0 I

Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

Drojdie - peptonă - glucoză-agar (YPGA)

Extract de levură (Difco) 5,0 g

Bacto-peptonă (Difco) 5,0 g

D (+) glucoza (monohidrat) 10,0 g

Bacto-agar (Difco) 15,0 g

Apă distilată 1,01

Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

Zaharoză - peptonă - agar (SPA)

Zaharoză 20,0 g

Bacto-peptonă (Difco) 5,0 g

K2HPO4 0,5 g

MgSO4·7H2O 0,25 g

Bacto-geloză (Difco) 15,0 g

Apă distilată 1,0 I pH 7,2-7,4

Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

Mediul tetrazoliu Kelman

Acizi casiminici (Difco) 1,0 g

Bacto-peptonă (Difco) 10,0 g

Dextroză 5,0 g

Bacto-agar (Difco) 15,0 g

Apă distilată 1,01

Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121 °C timp de 15 minute.

Se răceste la 50°C si se adaugă o solutie apoasă sterilizată prin filtrare de clorură de 2,3,5-trifeniltetrazoliu (Sigma) pentru obtinerea unei concentratii finale de 50 mg la litru.

b) Medii de crestere selective validate

Mediu SMSA (Englebrecht, 1994, modificat de Elphinstone ef al., 1996) Mediu de bază

Acizi casiminici (Difco) 1,0 g

Bacto-peptonă (Difco) 10,0 g

Glicerol 5,0 ml

Bacto-agar (Difco) (vezi nota 2) 15,0 g

Apă distilată 1,01

Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121 °C timp de 15 minute.

Se răceste la 50°C si se adaugă solutii apoase concentrate, sterilizate prin filtrare, continând următoarele ingrediente pentru obtinerea concentratiilor finale specificate:

Cristal violet (Sigma) 5 mg la litru

Sulfat de polimixină B (Sigma P-1004) 600.000 unităti (circa 100 mg) la litru

Bacitracină (Sigma B-0125) Cloramfenicol (Sigma C-3175) Penicilină-G (Sigma P-3032) Clorură de 2,3,5-trifeniltetrazoliu (Sigma)

Observatii:

1. Utilizarea altor reactivi decât cei mentionati anterior poate afecta cresterea bacteriei Ralstonia solanacearum.

2. Agarul de tip oxoid nr. 1 poate fi înlocuit de Bacto-agar (Difco). În acest caz, cresterea bacteriei Ralstonia solanacearum va fi mai lentă, dar si cresterea bacteriilor saprofite concurente ar putea fi, de asemenea, redusă. Dezvoltarea coloniilor tipice de Ralstonia solanaceamm poate dura o zi sau două în plus, iar coloratia rosie poate fi mai putin pronuntată decât pe mediu de Bacto-agar.

3. O crestere a concentratiei de bacitracină la 2.500 de unităti la litru poate reduce populatiile de bacterii concurente fără a perturba cresterea bacteriei Ralstonia solanacearum.

Mediile si solutiile concentrate de antibiotice se păstrează la 4°C la întuneric si timp de maximum o lună.

Trebuie asigurată absenta condensului pe suprafata plăcilor înainte de utilizare.

A se evita uscarea excesivă a plăcilor.

După prepararea fiecărui lot nou de mediu de cultură trebuie efectuat un control de calitate prin însământarea unei suspensii

1.250 unităti (circa 25 mg) la litru 5 mg la litru

825 unităti (circa 0,5 mg) la litru 50 mg la litru

dintr-o cultură de referintă de Ralstonia solanacearum (vezi apendicele 3) si se observă formarea de colonii tipice după incubarea la 28°C timp de 2-5 zile.

c) Medii de îmbogătire validate

Mediu nutritiv SMSA (Elphinstone et al., 1996)

Se prepară ca si pentru mediul selectiv SMSA, dar se elimină Bacto-agar si clorura de 2-3-5-tetrazoliu.

Mediu nutritiv modificat Wilbrink (Caruso et al., 2002)

Zaharoză 10 g

Proteoză peptonă 5 g

K2HPO4 0,5 g

MgS04 0,25 g

NaN03 0,25 g

Apă distilată 1 I

Se sterilizează prin autoclavare la 121 °C timp de 15 minute si se răceste la 50°C.

Se adaugă solutii concentrate de antibiotice ca si pentru mediul nutritiv SMSA.

 

Apendicele 3 A.

 

Material de control standardizat disponibil în comert

 

a) Tulpini bacteriene

Următoarele tulpini bacteriene se recomandă spre utilizare în calitate de material standard de referintă sau control pozitiv (tabelul 1) sau pe parcursul optimizării testelor pentru a evita reactiile încrucisate (tabelul 2). Toate tulpinile sunt disponibile în comert la următoarele adrese:

1. National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, UK;

2. Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Tările de Jos;

3. Collection francaise de bacteries phytopathogenes (CFBP), INRA- Station de phytobacteriologie, Angers, Franta. Tabelul 1. Tulpini de referintă SMT de Ralstonia solanacearum

 

Cod NCPPB

SMT#

Alte coduri

Tara de origine

Biovar

NCPPB 4153

6

CFBP 4582, Pr3020, EURS 11

Egipt

2

NCPPB 4154

10

CFBP 4585, 550, EURS 21

Turcia

2

NCPPB 3857

12

CFBP 4587, Pr 1140, EURS 26

Anglia

2

NCPPB1584

23

CFBP 4598, EURS 49

Cipru

2

NCPPB 2505

24

CFBP 4599, EURS 50

Suedia

2

NCPPB 4155

26

CFBP 4601,502, EURS 55

Belgia

2

NCPPB 4156(*)

71 O

PD 2762, CFBP 3857

Tările de Jos

2

NCPPB 4157

66

LNPV 15,59

Franta

2

NCPPB 4158

39

CFBP 4608, Port448, EURS 80, NCPPB 4066

Portugalia

2

NCPPB 4160

69

IVIA-1632-2

Spania

2

NCPPB 4161

76

B3B

Germania

2

NCPPB 325

41

CFBP 2047, KEL 60-1, R 842

Statele Unite

1

NCPPB 3967

42

CFBP 4610, R285, GONg7

Costa Rica

1

NCPPB 4028

43

CFBP 4611, R303/571, CIP 310, SEQ 205

Columbia

2

NCPPB 3985

44

CFBP 4612, R 578, CIP 312

Peru

2T

NCPPB 3989

45

CFBP 4613, R 568, CIP 226

Brazilia

2T

NCPPB 3996

46

CFBP 3928, R 276/355, CIP 72, SEQ 225

Peru

3

NCPPB 3997

47

CFBP 4614, R 280/363, CIP 49, HAY 0131a

Australia

3

NCPPB 4029

48

CFBP 4615, R 297/ 349, CIP 121, CMIb 2861

Sri Lanka

4

NCPPB 4005

49

CFBP 4616, R470

Filipine

4

NCPPB 4011

50

CFBP 4617, R288, Hemps 2

China

5

 

*)A se utiliza ca tulpină de referintă standard biovarul 2 rasa 3 de Ralstonia solanacearum.

 

notă: Autenticitatea tulpinilor mentionate anterior poate fi garantată numai în cazul în care acestea sunt obtinute dintr-o colectie de culturi atrtentice.

 

Tabelul 2. Tulpini de referintă SMT corelate serologic sau genetic în vederea utilizării pentru optimizarea testelor de detectie

 

Cod NCPPB

SMT#

Alt cod

Identificare

NCPPB4162

51

CFBP 1954

Bacillus polymyxa 1)

NCPPB 4163

52

CFBP1538

Pseudomonas marginalis pv. Marginalis 1)

NCPPB 4164

-

CFBP 2227

Burkholderia cepacia2)

NCPPB 4165

-

CFBP 2459

Ralstonia μlckettii2)

NCPPB 4166

58

CFBP 3567 CSLPM150

Ralstonia μlckettii1)

NCPPB 4167

60

CFBP 4618 PD 2778

Ralstonia sp 1)

NCPPB 1127

53

CFBP3575

Burkholderia andropogonis 1)

NCPPB 353

54

CFBP 3572

Burkholderia caryophylli1)

NCPPB 945

55

CFBP 3569

Burkholderia cepacia 1)

NCPPB 3708

56

CFBP 3574

Burkholderia glumae 1)

NCPPB 3590

57

CFBP 3573

Burkholderia plantarii1)

NCPPB 3726

59

CFBP 3568

Banana Blood Disease Bacterium 1),2),3)

NCPPB 4168

61

CFBP 4619 IPO S339

Enterobacter sp 1)

NCPPB 4169

62

IPO 1695

Enterobacter sp 1)

NCPPB4170

63

CFBP 4621 IPO S306

Ochrobactrum anthropi 1), 2)

NCPPB 4171

64

CFBP 4622 IPO 1693

Curtobacterium sp 1),2)

NCPPB 4172

65

IPO 1696a

Pseudomonas sp 1)

NCPPB 4173

 

PD2318

Aureobacteriu sp2)

NCPPB 4174

81

IVI A 1844.06

Flavobacterium sp1)-2)

 

1) Tulpină care poate determina în testele serologice (IF si/sau ELISA) o reactie încrucisată cu antiserurile policlonale.

2) Tulpină din care poate fi amplificat produsul PCR în anumite laboratoare, având dimensiuni asemănătoare celor preconizate la utilizarea primerilor specifici OLI-1 si Y-2 (vezi apendicele 6).

3)  Poate determina o reactie încrucisată în majoritatea testelor, dar cunoscut ca fiind prezent numai pe banan în Indonezia.

 

b) Material de control standardizat disponibil în comert Următorul material de control standardizat este disponibil în colectia de culturi NCPPB:

- granule liofilizate de extract din 200 tuberculi de cartof sănătosi în calitate de control negativ pentru ansamblul testelor;

- granule liofilizate de extract din 200 tuberculi de cartofi sănătosi continând 10M04 si 104-106 celule de biovar 2 de Ralstonia solanacearum (de exemplu, tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) în calitate de control pozitiv pentru testele serologice sl testul PCR. Întrucât liofilizarea afectează viabilitatea celulelor, acestea nu pot fi folosite drept control standard pentru testele de izolare sau testele biologice;

- suspensii fixate cu formalină de Ralstonia solanacearum biovar 2 (tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) de concentratie 106 celule/ml în calitate de control pozitiv pentru testele serologice.

B. Pregătirea controalelor pozitive si negative pentru testele rapide de detectie PCR/ F si FISH efectuate pe conuri de cartof

Se realizează o cultură de 48 de ore dintr-o tulpină virulentă de Ralstonia solanacearum biovar 2 rasa 3 (de exemplu, tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) pe mediu general SMSAsi se face o suspensie în tampon fosfat 10 mM pentru a obtine o densitate celulară de circa 2 x 108 ufc/ml. În general, aceasta se obtine printr-o suspensie usor tulbure echivalentă cu o densitate optică de 0,15-600 nm.

Se extrag conurile de la 200 de tuberculi de cartof, varietate cu coaja albă cunoscută ca fiind neinfectată cu Ralstonia solanacearum.

Conurile se tratează după metoda obisnuită si se resuspendă sedimentul în 10 ml.

Se pregătesc 10 microfiole sterile de 1,5 ml cu 900 ui de sediment resuspendat.

Se transferă 100 ui din suspensia de Ralstonia solanacearum în prima microfiolă si se omogenizează prin vortexare.

Se realizează dilutii zecimale în următoarele 5 microfiole.

Cele 6 microfiole contaminate vor fi utilizate drept control pozitiv. Cele 4 microfiole necontaminate se vor folosi în calitate de control negativ. Se etichetează microfiolele în mod corespunzător.

Se prepară alicote de 100 μl în microfiole sterile de 1,5 ml pentru a obtine 9 replici din fiecare control. Se conservă la -16 si - 24°C până la utilizare.

Prezenta si concentratia de celule de Ralstonia solanacearum în control trebuie confirmate în primul rând prin IF.

Pentru testul PCR, se efectuează o extractie de ADN din controale pozitive si negative pentru fiecare serie de probe de testare.

Pentru testele IF si FISH, se efectuează teste asupra controalelor pozitive si negative pentru fiecare serie de probe de testare.

Pentru testele IF si FISH, nivelul de detectie al celulelor de Ralstonia solanacearum trebuie să fie de cel putin 106 si 104 celule/ml în controlul pozitiv, iar în controlul negativ să nu fie detectate.

 

Apendicele 4

 

Tampoane pentru procedura de testare

 

Generalităti: tampoanele sterilizate nedeschise pot fi păstrate până la un an.

1. Solutii-tampon pentru procedura de extractie

1.1. Tampon de extractie (50 mM tampon fosfat, pH 7,0)

Acest tampon este utilizat pentru extractia bacteriei din tesuturile plantei prin omogenizare sau agitare. Na2HPO4 4,26 g

KH2PO4 2,72 g

Apă distilată 1, 00 I

Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul si se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute. Utilizarea următorilor compusi suplimentari poate fi utilă:

 

 

Utilizare

Cantitate (la I)

Fulgi de Lubrol

Peptizant (*)

0,5 g

Silicon antispumant DC

Agent antispumant (*)

1,0 ml

Pirofosfat tetrasodic

Antioxidant

1,0 g

Polivinilpirolidonă-40000 (PVP-40)

Legarea inhibitorilor PCR

50 g

 

(*) A se utiliza cu metoda de extractie prin omogenizare.

1.2. Tampon de extract concentrat (10 mM tampon fosfat, pH 7,2)

Acest tampon este utilizat pentru resuspendarea si dilutia extractelor de conuri de tuberculi de cartof ca urmare a concentrării prin centrifugare.

Na2HPO4-12H20 2,7 g

NaH2PO4-2H20 0,4 g

Apă distilată 1,01

Se dizolvă ingredientele si se verifică pH-ul. Se sterilizează prin autoclavare la 121 °C timp de 15 minute.

2. Solutii-tampon pentru testul de imunofluorescentă

2.1. Tampon IF: 10 mM PBS, pH 7,2

Acest tampon este utilizat pentru dilutia anticorpilor.

Na2HPO4·12H20  2,7 g

NaH2PO4·2H20 0,4 g

NaCI 8,0 g

Apă distilată 1,01

Se dizolvă ingredientele si se verifică pH-ul. Se sterilizează prin autoclavare la 121 °C timp de 15 minute.

2.2. Tampon IF-Tween

Acest tampon este utilizat pentru spălarea lamelor. Se adaugă 0,1 % Tween 20 la tamponul IF.

2.3. Tampon glicerol fosfat, pH 7,6

Acest tampon este utilizat pentru montarea lamei IF pentru mărirea fluorescentei.

Na2HPO4·12H20 3,2 g

NaH2PO4·2H20 0,15 g

Glicerol 50 ml

Apă distilată 100 ml

în comert sunt disponibile solutii-suport antidecolorare, de exemplu, Vectashield® (Vector Laboratories) sau Citifluor® (Leica).

3. Solutii tampon pentru testul ELISA indirect

3.1. Tampon de acoperire dublu concentrat, pH 9,6

Na2CO3 6,36 g

NaHCO? 11,72 g

Apă distilată 1,00 I

Se dizolvă ingredientele si se verifică pH-ul. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

Poate fi adăugat sulfit de sodiu (0,2 %) ca antioxidant pentru a împiedica constituirea de compusi aromatici oxidati.

3.2. 10 x tampon de fosfat salin (PBS), pH 7,4

NaCI 80,0 g

KH2PO4 2,0 g

Na2HPO4·12H20 29,0 g

KCl 2,0 g

Apă distilată 1,01

3.3. PBS-Tween

10 x PBS 100 ml

10% Tween 20 5 ml

Apă distilată 895 ml

3.4. Tampon de blocare (anticorpi) (trebuie preparat proaspăt)

10 x PBS 10,0 ml

 

 

Polivinilpirolidonă-44000 (PVP-44) 2,0 g

10%Tween20 0,5 ml

Lapte praf 0,5 g

Apă distilată până la 100 ml

3.5. Solutie de substrat de fosfatază alcalină, pH 9,8 Dietanolamină 97 ml

Apă distilată 800 ml

Se amestecă si se ajustează la pH 9,8 cu acid clomidric (HCI) concentrat.

Se adaugă apă distilată până la 1 litru.

Se adaugă 0,2 g MgCI.

Se dizolvă două tablete de 5 mg de substrat de fosfatază (Sigma) la 15 ml de solutie.

 

4. Tampoane pentru testul DASI ELISA

4.1. Tampon de acoperire dublu concentrat, pH 9,6

 

Na2CO3

 

1,59 g

NaHCO3

 

2,93 g

Apă distilată

 

1.000 ml

Se dizolvă ingredientele si se verifică pH-ul.

 

 

4.2. 10 x tampon de fosfat salin (PBS), pH 7,2-7,4

 

NaCI

 

80,0 g

NaH2PO4-2H20

 

4,0 g

Na2HPO4-12H20

 

27,0 g

Apă distilată

 

1.000 ml

4.3. PBS-Tween

 

 

10 x PBS

 

50 ml

10%Tween20

 

5 ml

Apă distilată

 

950 ml

4.4. Tampon de substrat, pK 9,8

 

Dietanolamină

 

100 ml

Apă distilată

 

900 ml

 

Se amestecă si se ajustează la pH 9,8 cu acid clomidric (HCI) concentrat.

 

Apendicele 5

 

Stabilirea gradului de contaminare în testele IF si FISH

 

1. Se calculează numărul mediu de celule fluorescente tipice pe câmp (c).

2. Se calculează numărul de celule fluorescente tipice pe godeul lamei de microscop (C).

C = c x S/s, unde: S = suprafata (S) a godeului lamei cu multe godeuri, si

s = suprafata (s) câmpului obiectivului

s = Tri2/4G2K2, unde: i = coeficientul de câmp (depinde de tipul ocularului si variază de la 8 la 24)

K = coeficientul tubului (1 sau 1,25) G = grosisment (de 100 de ori, 40 de ori etc.) obiectiv.

3. Se calculează numărul de celule fluorescente tipice pe ml de sediment resuspendat (N). N = Cx1.000/yxF,

unde: y = volumul de extract concentrat resuspendat per godeu,

si F = factorul de dilutie al sedimentului resuspendat

 

Apendicele 6

 

Protocoale PCR si reactivi validati

 

notă: Testele preliminare trebuie să permită detectia reproductibilă a 103-104 celule de Ralstonia solanacearum pe ml de extract de probă

De asemenea, testele preliminare nu trebuie să indice rezultate fals pozitive cu o gamă de tulpini bacteriene selectionate (vezi apendicele 3).

 

1. Protocolul PCR Seal et al. (1993)

1.1. Secventa de oligonucleotide a primerilor

Primer sensOLI-1 5-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3

Primer antisens Y-2 5-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3

Dimensiunea prevăzută a ampliconului de ADN-tintă de Ralstonia solanacearum = 288 bp

1.2. Amestecul reactiv pentru PCR

 

Reactiv

Cantitate per reactie

Concentratie finală

Apă ultrapură sterilă

17,65 μl

 

Tampon PCR x 101 (15 mM MgCl2)

Amestec dNTP (20 mM)

Primer OLI-1 (20 pM)

Primer Y-2 (20 mM)

Polimerază Taq (5 U/m1) 1

2,5 Ml

0,25 Ml

1,25 Ml

1,25 Ml

0,1 Ml

1x(1,5mMMgCI2)

0,2 mM

1 μM

1 μM

0,5 U

Volumul de ADN extras din probă

2,0 Ml

 

Volum total

25 Ml

 

 

1 Metoda a fost validată cu Taq polimerază de PerkinElmer (AmpliTaq) si Gibco BRL.

 

1.3. Conditiile reactiei PCR Se urmează procedura:

1 ciclu de: (i) 2 minute la 96°C: denaturarea matritei ADN

35 cicluri de: (ii) 20 secunde la 94°C: denaturarea matritei ADN

(iii) 20 secunde la 68°C: hibridizare cu primeri

(iv) 30 secunde la 72°C: extinderea ADN

1 ciclu de: (v) 10 minute la 72°C (extinderea finală)

(vi) Se mentine la 4°C.

 

notă: Acest program a fost optimizat pentru termociclorul PerkinElmer 9600. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor (ii), (iii) si (iv) pentru o utilizare cu alte modele de termociclor.

 

1.4. Analiza restrictiei enzimatice a ampliconului

Fragmentele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restrictie după incubare la 37°C cu enzima Ava II.

2. Protocolul PCR Pastrik & Maiss (2000)

2.1. Secventa de oligonucleotide a primerilor

Primer sensPs-1 5-AGT CGA ACG GCA GCG GGG G-3

Primer antisens Ps-2 5-GGG GAT TTC ACA TCG GTC TTG CA-3

Dimensiunea prevăzută a ampliconului ADN-ului-tintă de Ralstonia solanacearum = 553 bp.

2.2. Amestecul reactiv pentru PCR

 

 

Reactiv

Cantitate per reactie

Concentratie finală

Apă ultrapură sterilă

16,025 μl

 

Tampon PCR x101

2,5 μl

1x(1,5mMMgCI2)

BSA (fractiune V) (10%)

0,25 Ml

0,1 %

Amestec dNTP (20 mM)

0,125 Ml

0,1 mM

Primer Ps-1 (10 pM)

0,5 Ml

0,2 pM

Primer Ps-2 (10 mM)

0,5 Ml

0,2 mM

Polimerază Taq (5 U/pl)1

0,1 Ml

0,5 U

Volumul de ADN extras din probă

5,0 Ml

 

Volum total

25,0 Ml

 

 

1 Metodele au fost validate cu Taq polimerază de PerkinElmer (AmpliTaq) si Gibco BRL.

 

notă: Optimizată initial pentru termociclorul MJ Research PTC 200 cu polimerază Taq Gibco.

 

AmpliTaq de PerkinElmer si tamponul pot fi utilizate, de asemenea, la aceleasi concentratii.

 

2.3. Conditiile reactiei PCR

 

Se urmează procedura:

-

1 ciclu de: (i)

5 minute la 95°C: denaturarea matritei ADN

35 cicluri de: (ii)

30 secunde la 95°C: denaturarea matritei ADN

(iii)

30 secunde la 68°C: hibridizare cu primeri

(iv)

45 secunde la 72°C: extinderea ADN

1 ciclu de: (v)

5 minute la 72°C (extinderea finală)

(vi)

Se mentine la 4°C.

 

 

notă: - Acest program a fost optimizat pentru termociclorul MJ Research PTC 200.

Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor (ii) (iii) si (iv) pentru o utilizare cu alte modele de termociclor.

 

2.4. Analiza restrictiei enzimatice a ampliconului

Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentele de restrictie după incubare la 65°C cu enzima Taq I timp de 30 de minute. Fragmentele de restrictie obtinute din fragmentul specif de ADN de Ralstonia solanacearum au o lungime de 457 bp si de 96 bp.

3. Protocolul multiplex PCR si cu control intern al PCR (Pastrik era/., 2002)

3.1. Secventa de primer de oligonucleotide

Primer sens Rs-1-F 5’-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3

Primer antisens Rs-t-R 5 -CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3

Primer sens Ns-5-F 5’-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3

Primer antisens Ns-6-R 5’-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3

Dimensiunea prevăzută a ampliconului ADN-tintă de Ralstonia solanacearum = 718 bp (în prezenta setului de primeri Rs) Dimensiunea prevăzută a ampliconului controlului intern al PCR de 18S ARNr = 310 bp (în prezenta setului de primeri Ns)

 

3.2. Amestecul reactiv pentru PCR

 

Reactiv

Cantitate per reactie

Concentratie finală

Apă ultrapură sterilă

12,625 μl

 

Tampon PCR x 101 (1,5 mM MgCl)

2,5 μl 1 x(1,5 mM MgCI2)

 

BSA (fractiune V) (10 %)

0,25 μl 0,1 %

 

Amestec dNTP (20 mM)

0,125 μl 0,1 mM

 

Primer Rs-1-F (10 pM)

2,0 μl 0,8 pM

 

Primer Rs-1-R (10 pM)

2,0 μl 0,8 pM

 

Primer Ns-5-F (10 pM)2

0,15 μl 0,06 pM

 

Primer Ns-6-R (10 pM)2

0,15 μl 0,06 pM

 

PolimerazăTaq(5U/pl)1

0,2 μl

1,0 U

Volumul de ADN extras din probă

5,0 μl

 

Volum total 25,0 μl

 

 

 

1 Metodele au fost validate cu polimerază Taq de PerkinElmer (AmpliTaq) si Gibco BRL.

2 Concentratiile primerilor Ns-5-F si Ns-6-R au fost optimizate pentru extractia conurilor de cartof, utilizându-se metoda de omogenizare si pentru metoda de izolare a ADN Pastrik (2000) (vezi sectiunea VI. A.6.1 .a). Va fi nevoie de o nouă optimizare a concentratiilor de reactivi în cazul în care se aplică extractia prin agitare si se folosesc alte metode de izolare de ADN.

 

3.3. Conditiile reactiei PCR Se urmează procedura:

1 ciclu de:

(i) 5 minute la 95°C: denaturarea matritei ADN

35 cicluri de:

(ii) 30 secunde la 95°C: denaturarea matritei ADN

(iii) 30 secunde la 58°C: hibridizare cu primeri

(iv) 45 secunde la 72°C: extinderea ADN

1 ciclu de: (v) 5 minute la 72°C (extinderea finală)

(vi) Se mentine la 4°C.

 

notă: Acest program a fost optimizat pentru termociclorul MJ Research PTC 200. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor (ii), (iii) si (iv) pentru utilizarea cu alte modele de termociclor.

3.4. Analiza restrictiei enzimatice a ampliconului

Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restrictie după incubare la 65°C cu enzima Bsm I sau cu o enzimă izoschizomeră (de exemplu, Mva 1269 I) timp de 30 de minute.

4. Protocolul PCR biovar specific de Ralstonia solanacearum (Pastrik era/., 2001)

4.1. Secventa de oligonucleotide a primerilor

Primer sensRs-1 -F 5-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3

Primer antisens Rs-1 -R 5-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3

Primer antisens Rs-3-R 5 -TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3

Dimensiunea prevăzută a ampliconului ADN-tintă de Ralstonia solanacearum: cuRs-1-F/Rs-1-R = 718bp cu Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp.

4.2. Amestecul reactiv pentru PCR a) PCR specific biovarului ˝

 

 

Reactiv

Cantitate per reactie

Concentratie finală

Apă ultrapură sterilă

12,925 μl

 

Tampon PCR x101

2,5 μl

1 x(1,5mMMgCl2)

BSA (fractiune V) (10%)

0,25 μl

0,1 %

Amestec dNTP (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Primer Rs-1-F (10 pM)

2 μl

0,8 μM

Primer Rs-1-R (10 mM)

2 μl

0,8 μM

Polimerază Taq (5 U/pl)1

0,2 ul

1 U

Volumul de ADN extras din probă

5,0 μl

 

Volum total

25,0 μl

 

 

1 Metodele au fost validate cu polimerază Taq PerkinElmer (AmpliTaq) si Gibco BRL. b) PCR specific biovarului 3/4/5

 

Reactiv

Cantitate per reactie

Concentratie finală

Apă ultrapură sterilă

14,925 μl

 

Tampon PCRx 101

BSA(fractiuneV)(10%)

Amestec dNTP (20 mM)

Primer Rs-1-F (10 uM)

Primer Rs-3-R (10 uM)

Polimerază Taq (5 U/ul)1

2,5 Ml

0,25 Ml

0,125 μl

1 μl

1 μl

0,2 μl

1x(1,5mMMgCl2)

0,1%

0,1 mM

0,4 μM

0,4 μM

1 U

Volumul de ADN extras din probă

5,0 μl

 

Volum total

25,0 μl

 

 

1 Metodele au fost validate cu polimerază Taq PerkinElmer (AmpliTaq) si Gibco BRL.

 

4.3. Conditiile reactiei PCR

Se urmează procedura descrisă în continuare pentru reactiile specifice biovarului 1/2 si biovarului 3/4/51

1 ciclu de: (i) 5 minute la 95°C: denaturarea matritei ADN

35 cicluri de: (ii) 30 secunde la 95°C: denaturarea matritei ADN

(iii) 30 secunde la 58°C: hibridizare cu primeri

(iv) 45 secunde la 72°C: extinderea ADN

1 ciclu de: (v) 5 minute la 72°C (extinderea finală)

(vi) Se mentine la 4°C.

 

notă: Acest program a fost optimizat pentru termociclorul MJ Research PTC 200. Poate fi necesară o mbdificare a duratei ciclurilor (ii), (iii) si (iv) pentru utilizarea cu alte modele de termociclor.

 

4.4. Analiza restrictiei enzimatice a amplimerului Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR utilizând primerii Rs-1-F si Rs-1-R produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restrictie după incubare la 65CC cu enzima Bsm I sau cu o enzima izoschizomeră (de exemplu, Mva 1269 I) timp de 30 de minute. Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR utilizând primerii Rs-1-F si Rs-3-R nu au puncte de restrictie.

5. Prepararea tamponului de încărcare

5.1. Albastru de bromfenol (solutie concentrată de 10%)

Albastru de bromfenol 5 g

Apă distilată (bidistilată) 50 ml

5.2. Tampon de încărcare

Glicerol (86%) 3,5 ml

Albastru de bromfenol (5.1) 300 μl

Apă distilată (bidistilată) 6,2 ml

6. Tampon tris-acetat EDTA (TAE) 10 x, pH 8,0

Tampon TRIS 48,40 g

Acid acetic glacial 11,42 ml

EDTA (sare disodică) 3,72 g

Apă distilată 1,00 I

înainte de utilizare se diluează până la 1 x. De asemenea, acest tampon este disponibil în comert (de exemplu, Invitrogen sau echivalent).

 

Apendicele 7

 

Reactivi validati pentru testul FISH

 

1. Oligosonde

Sondă OLI-1-CY3 specifică Ralstonia solanacearum: 5-GGC AGG TAG CAA GCT ACC CCC-3

Sondă eubacteriană EUB-338-FITC nespecifică: 5-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3

2. Solutia de fixare

Atentie! Solutia de fixare contine paraformaldehidă, care este toxică, se manipulează cu mănusi si nu se inhalează. Se recomandă să se lucreze într-o hotă chimică.

(i) Se încălzesc 9 ml de apă pentru biologie moleculară (de exemplu, apă ultrapură) la circa 60°C si se adaugă 0,4 g de paraformaldehidă. Paraformaldehidă se dizolvă după adăugarea a 5 μlcături de NaOH 1N si amestecarea pe un agitator magnetic.

(ii) Se ajustează pH-ul la 7,0 prin adăugarea a 1 ml de tampon fosfat 0,1 M (PB; pH 7,0) si 5 picături de HC11 N. Se verifică pH-ul cu benzi indicatoare si se ajustează, atunci când este necesar, cu HCI sau NaOH.

Atentie! Nu se foloseste pH-metrul în solutii care contin paraformaldehidă.

(iii) Se filtrează solutia printr-un filtru cu membrană de 0,22 pm si se păstrează la 4°C până la utilizare ferită de praf.

3. Hibmix 3 x

NaCI 2,7 M

Tris/HCI 60 mM (pH 7,4)

EDTA (sterilizată prin filtrare 15 mM

si autoclavată)

Se diluează până la 1 x, după cum este prevăzut.

4. Solutie de hibridizare

Se prepară cantitătile de solutie de hibridizare în conformitate cu

 

4. Solutie de hibridizare