MONITORUL OFICIAL AL ROMANIEI
P A R T E A I
Anul
175 (XIX) - Nr. 524 LEGI,
DECRETE, HOTĂRÂRI SI ALTE ACTE
Joi, 2 august 2007
SUMAR
HOTĂRÂRI ALE GUVERNULUI ROMÂNIEI
718. - Hotărâre privind
aprobarea Acordului dintre Guvernul României si Guvernul Republicii Ungare,
semnat la Bucuresti la 21 decembrie 2006, pentru aplicarea Conventiei dintre
România si Republica Ungară privind controlul traficului de frontieră
rutier si feroviar, semnată la Bucuresti la 27 aprilie 2004
Acord între Guvernul României si Guvernul Republicii
Ungare pentru aplicarea Conventiei dintre România si Republica Ungară
privind controlul traficului de frontieră rutier si feroviar, semnată
la Bucuresti la 27 aprilie 2004
747. - Hotărâre privind
reglementarea actiunilor specifice aferente finantării asistentei din
cadrul politicii nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare
ACTE ALE ORGANELOR DE SPECIALITATE ALE ADMINISTRATIEI
PUBLICE CENTRALE
586. - Ordin al ministrului
agriculturii si dezvoltării rurale privind controlul bacteriei Ralstonia
solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.
762. - Ordin al ministrului economiei
si finantelor privind modificarea Instructiunilor pentru stabilirea procedurii
privind efectuarea operatiunilor necesare pentru finantarea de la bugetul de
stat în cazul indisponibilitătii temporare a contributiei financiare a
Comunitătii Europene si în cazul compensărilor efectuate de Comisia
Europeană, precum si pentru tratamentul dobânzii acumulate în conturile
bancare ale Fondului National în cadrul programelor ISPA, aprobate prin Ordinul
ministrului finantelor publice nr. 296/2007
832/1.215/347/146. - Ordin al ministrului
agriculturii si dezvoltării rurale, al ministrului
sănătătii publice, al presedintelui Autoritătii Nationale
pentru Protectia Consumatorilor si al presedintelui Autoritătii Nationale
Sanitare Veterinare si pentru Siguranta Alimentelor privind modificarea anexei
nr. 2 la Normele cu privire la natura, continutul, fabricarea, calitatea,
ambalarea, etichetarea, marcarea si păstrarea sucurilor de legume,
aprobate prin Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor,
al ministrului sănătătii si familiei si al presedintelui
Autoritătii Nationale pentru Protectia Consumatorilor nr. 359/671/137/2002
1.252. - Ordin al
ministrului sănătătii publice privind stabilirea cuantumului
sumei de participare la concursul organizat pentru ocuparea postului de manager
general, persoană fizică, din serviciile de ambulantă judetene
si al municipiului Bucuresti
HOTĂRÂRI ALE GUVERNULUI ROMÂNIEI
GUVERNUL ROMÂNIEI
privind aprobarea Acordului dintre Guvernul României si Guvernul Republicii
Ungare, semnat la Bucuresti la 21 decembrie 2006, pentru aplicarea Conventiei
dintre România si Republica Ungară privind controlul traficului de
frontieră rutier si feroviar, semnată la Bucuresti la 27 aprilie 2004
În temeiul art. 108 din Constitutia României,
republicată, si al art. 20 din Legea nr. 590/2003 privind tratatele,
Guvernul României adoptă prezenta hotărâre.
Articol unic. - Se aprobă Acordul dintre Guvernul
României si Guvernul Republicii Ungare, semnat la Bucuresti la 21 decembrie
2006, pentru aplicarea Conventiei dintre România si Republica Ungară
privind controlul traficului de frontieră rutier si feroviar, semnată
la Bucuresti la 27 aprilie 2004, ratificată prin Legea nr. 191/2005.
PRIM-MINISTRU
CALIN POPESCU-TĂRICEANU
Contrasemnează:
p. Ministrul internelor si reformei administrative,
Liviu Radu,
secretar de stat
Ministrul transporturilor,
Ludovic Orban
Ministrul afacerilor externe,
Adrian Mihai Cioroianu
Ministrul economiei si finantelor,
Bucuresti, 4 iulie 2007.
Nr. 718.
ACORD
între Guvernul României si Guvernul Republicii Ungare
pentru aplicarea Conventiei dintre România si Republica
Ungară privind controlul traficului de
frontieră rutier si feroviar, semnată la Bucuresti la 27 aprilie 2004
În conformitate cu prevederile art. 3 alin. (4) din
Conventia dintre România si Republica Ungară privind controlul traficului
de frontieră rutier si feroviar, semnată la Bucuresti la 27 aprilie
2004, denumită în continuare Conventie,
Guvernul României si Guvernul Republicii Ungare, denumite
în continuare părti contractante,
în scopul facilitării punerii în aplicare a
Conventiei,
în vederea accelerării si simplificării
controlului traficului la frontiera de stat comună prin intermediul
colaborării dintre autoritătile tor,
având în vedere Concluziile Parlamentului European si ale
Consiliului adoptate la 27 noiembrie 2003, referitoare la aprobarea
conventiilor bilaterale de cooperare privind controlul persoanelor la
frontierele comune de uscat ale unor state membre ale Uniunii Europene în urma
extinderii, precum si dispozitiile referitoare la controalele comune
prevăzute în Codul comunitar asupra regulilor privind circulatia
persoanelor peste frontiere (denumit în continuare Codul frontierelor
Schengen), stabilit prin Regulamentul Parlamentului European si al
Consiliului nr. 562/2006/CE,
au convenit următoarele:
CAPITOLUL I
Dispozitii generale
ARTICOLUL 1 (1)
În scopul celor de mai sus, părtile contractante
convin să controleze împreună, în cadrul unei singure opriri, persoanele
care trec frontiera prin punctele rutiere de trecere a frontierei
româno-maghiare, precum si obiectele aflate în proprietatea acestora si
mijloacele de transport. În cursul controlului comun la o singură oprire,
efectuat potrivit dispozitiilor art. 7 din Codul frontierelor Schengen,
autoritătile competente ale părtilor contractante efectuează
controlul în cadrul propriei lor sfere de atributii.
(2) Expresiile utilizate în prezentul acord au sensul
stabilit în Conventie.
(3) Autoritătile competente ale părtilor
contractante se informează reciproc asupra modernizării punctelor de
trecere a frontierei care implică si cealaltă parte
contractantă, respectiv asupra limitărilor, devierilor provizorii de
trafic si asupra lucrărilor care
implică locurile de serviciu, cu suficient timp înaintea începerii
acestora.
(4) Părtile contractante stabilesc în scris si
publică, conform legislatiei lor interne, drumurile care traversează
frontiera de stat pe care pot fi transportate mărfuri periculoase.
(5) În cursul punerii în aplicare a prezentului acord,
limbile de contact între persoanele de serviciu sunt limbile română si
maghiară. Cu ocazia mentinerii legăturii, personalul de serviciu
poate conveni si asupra folosirii unei alte limbi.
ARTICOLUL 2
(1) Controlul traficului de frontieră în traficul
feroviar se efectuează în stationare, pe timpul stationării trenului
în punctul de trecere a frontierei.
(2) La punctele feroviare de trecere a frontierei,
personalul de serviciu al fiecărei părti contractante efectuează
separat controlul traficului de frontieră, pe teritoriul propriului
său stat.
(3) În vederea fluidizării controlului traficului
feroviar al persoanelor, respectiv al circulatiei feroviare, precum si în
scopul reducerii timpului de asteptare, părtile contractante pot conveni
asupra controlului comun, din mers, al traficului feroviar de persoane, asupra
regulilor detaliate si conditiilor controlului, în primul rând pe tronsoanele
de cale ferată dintre statiile feroviare Arad-Curtici (Kurtos) – Lökösháza
- Békéscsaba, precum si dintre Oradea (Nagyvárad)-Episcopia Bihorului
(Biharpüspöki)- Biharkeresztes – Püspökladány.
ARTICOLUL 3
(1) Autoritătile de control al traficului de
frontieră ale părtilor contractante vor stabili printr-o întelegere
regulile privind regimul de functionare a punctelor de trecere a frontierei.
(2) Întelegerea privind regimul functionării
punctelor de trecere a frontierei trebuie să cuprindă
următoarele:
a) regulile primirii autovehiculelor;
b) locul sl regulile controlului;
c) alte conditii necesare efectuării controlului
(cum ar fi scoaterea de sub tensiune a garniturilor de tren);
d) modul de întoarcere la frontiera comună a
persoanelor si bunurilor;
e) locul de control al mărfurilor periculoase si
transporturilor de animale vii;
f) regulile privind măsurile necesare în cazul unor
accidente grave sau al altor evenimente deosebite petrecute la punctul de
trecere a frontierei;
g) modul de amplasare a inscriptiilor informative pe
teritoriul punctului de trecere a frontierei;
h) regulile referitoare la prevenirea si eliminarea
încălcării dispozitiilor stabilite în regulamentul punctului de
trecere a frontierei;
i) parcările de serviciu desemnate.
CAPITOLUL II
ARTICOLUL 4
(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru
traficul international de persoane, precum si pentru traficul international de
mărfuri, până la limita de greutate totală de 7,5 tone.
(2) Controlul traficului international de persoane care
ies de pe teritoriul Republicii Ungare si intră pe teritoriul României
prin punctul de trecere rutier Cenad (Nagycsanád) - Kiszombor - inclusiv
controlul persoanelor participante la traficul international de mărfuri -
are loc pe teritoriul României, într-un loc comun, în acest scop pe teritoriul
României se înfiintează un loc de serviciu maghiar pentru controlul
traficului de frontieră.
(3) Controlul traficului international de persoane care
ies de pe teritoriul României si intră pe teritoriul Republicii Ungare -
inclusiv controlul persoanelor participante la traficul international de
mărfuri - are loc pe teritoriul Republicii Ungare, într-un loc comun. În
acest scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de
serviciu român pentru controlul traficului de frontieră.
(4) Programul de lucru al punctului de trecere a
frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.
(5) Pentru personalul de serviciu maghiar, teritoriul de
functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră,
existent pe teritoriul României, se extinde asupra:
a) încăperilor de serviciu desemnate,
încăperilor comune;
b) drumului public care duce de la frontiera de stat la
locul de serviciu;
c) benzilor de circulatie de control;
d) parcării de serviciu.
(6) Pentru personalul de serviciu român, teritoriul de
functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră,
existent pe teritoriul Republicii Ungare, se extinde asupra:
a) încăperilor de serviciu desemnate,
încăperilor comune;
b) drumului public care duce de la frontiera de stat la
locul de serviciu;
c) benzilor de circulatie de control;
d) parcării de serviciu.
(7) În cazul creării conditiilor necesare de
personal, tehnice si de infrastructură, părtile contractante
autorizează traficul international de mărfuri prin punctul de trecere
a frontierei, până la limita unei greutăti totale de 12,5 tone,
despre a cărui introducere se va conveni pe cale diplomatică.
ARTICOLUL 5
(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru
traficul international de persoane si de mărfuri.
(2) Controlul traficului de persoane care ies de pe
teritoriul Republicii Ungare si intră pe teritoriul României prin punctul
de trecere rutier de la Nădlac (Nagylak} - Nagylak are loc pe teritoriul
României, într-un loc comun. In acest scop pe teritoriul României se
înfiintează un loc de serviciu maghiar pentru controlul traficului de
frontieră.
(3) Controlul traficului international de persoane care
ies de pe teritoriul României si intră pe teritoriul Republicii Ungare are
loc pe teritoriul Republicii Ungare, într-un loc comun. In acest scop pe
teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român
pentru controlul traficului de frontieră.
(4) Controlul persoanelor participante la traficul
international de mărfuri la punctul de trecere a frontierei indicat la
alin. (1) are loc într-un loc comun pe teritoriul Republicii Ungare. În acest
scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu
român pentru controlul traficului de frontieră.
(5) Programul de lucru al punctului de trecere a
frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.
(6) Pentru personalul de serviciu maghiar, teritoriul de
functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră,
existent pe teritoriul României, se extinde asupra:
a) încăperilor de serviciu desemnate,
încăperilor comune;
b) drumului public care duce de la frontiera de stat la
locul de serviciu;
c) benzilor de circulatie de control;
d) parcării de serviciu.
(7) Pentru
personalul de serviciu român, teritoriul de functionare la locul de serviciu
pentru controlul traficului de frontieră, existent pe teritoriul
Republicii Ungare, se extinde asupra:
a) încăperilor de serviciu desemnate,
încăperilor comune;
b) drumului public care duce de la frontiera de stat la
locul de serviciu;
c) benzilor de circulatie de control si cabinelor de
serviciu aferente acestora, atât pe terminalul de iesire, cât si de intrare;
d) parcării de serviciu.
ARTICOLUL 6
(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru
traficul international de persoane, precum si pentru traficul international de
mărfuri, până la limita de greutate totală de 7,5 tone.
(2) Controlul traficului de persoane care ies de pe
teritoriul Republicii Ungare si intră pe teritoriul României prin punctul
de trecere rutier Turnu (Tomya) - Battonya - inclusiv controlul persoanelor
participante la traficul international de mărfuri - are loc pe teritoriul
României, într-un loc comun. În acest scop pe teritoriul României se
înfiintează un loc de serviciu maghiar pentru controlul traficului de
frontieră.
(3) Controlul traficului international de persoane care
ies de pe teritoriul României si intră pe teritoriul Republicii Ungare -
inclusiv controlul persoanelor participante la traficul international de
mărfuri - are loc pe teritoriul Republicii Ungare, într-un loc comun. În
acest scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de
serviciu român pentru controlul traficului de frontieră.
(4) Programul de lucru al punctului de trecere a
frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.
(5) Pentru personalul de serviciu maghiar, teritoriul de
functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră,
existent pe teritoriul României, se extinde asupra:
a) încăperilor de serviciu desemnate,
încăperilor comune;
b) drumului public care duce de la frontiera de stat la
locul de serviciu;
c) benzilor de circulatie de control;
d) parcării de serviciu.
(6) Pentru personalul de serviciu român, teritoriul de
functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră,
existent pe teritoriul Republicii Ungare, se extinde asupra:
a) încăperilor de serviciu desemnate,
încăperilor comune;
b) drumului public care duce de la frontiera de stat la
locul de serviciu;
c) benzilor de circulatie de control;
d) parcării de serviciu.
ARTICOLUL 7
(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru
traficul international de persoane si de mărfuri.
(2) Controlul traficului de persoane care ies de pe
teritoriul Republicii Ungare si intră pe teritoriul României pe la punctul
de trecere rutier Vărsând (Gyulavarsănd) - Gyula are loc pe
teritoriul României, într-un loc comun. În acest scop pe teritoriul României se
înfiintează un loc de serviciu maghiar pentru controlul traficului de
frontieră.
(3) Controlul traficului international de persoane care
ies de pe teritoriul României si intră pe teritoriul Republicii Ungare are
loc pe teritoriul Republicii Ungare, într-un loc comun. În acest scop pe
teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român
pentru controlul traficului de frontieră.
(4) Controlul persoanelor participante la traficul
international de mărfuri la punctul de trecere a frontierei indicat la
alin. (1) are loc într-un loc comun de pe teritoriul Republicii Ungare. În
acest scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de
serviciu român pentru controlul traficului de frontieră.
(5) Programul de lucru al punctului de trecere a frontierei
este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.
(6) Pentru personalul de serviciu maghiar, teritoriul de
functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră,
existent pe teritoriul României, se extinde asupra:
a) încăperilor de serviciu desemnate,
încăperilor comune;
b) drumului public care duce de la frontiera de stat la
locul de serviciu;
c) benzilor de circulatie de control;
d) parcării de serviciu.
(7) Pentru personalul de serviciu român, teritoriul de
functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră,
existent pe teritoriul Republicii Ungare, se extinde asupra:
a) încăperilor de serviciu desemnate,
încăperilor comune;
b) drumului public care duce de la frontiera de stat la
locul de serviciu;
c) benzilor de circulatie de control si cabinelor de
serviciu aferente acestora, atât pe terminalul de iesire, cât si de intrare;
d) parcării de serviciu.
ARTICOLUL 8
(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru
traficul international de persoane, precum si pentru traficul international de
mărfuri, până la limita de greutate totală de 7,5 tone.
(2) Controlul traficului de persoane care ies de pe
teritoriul Republicii Ungare si intră pe teritoriul României pe la punctul
de trecere rutier de la Salonta (Nagyszalonta) - Mehkerek - inclusiv controlul
persoanelor participante la traficul international de mărfuri - are loc pe
teritoriul României, într-un loc comun, în acest scop pe teritoriul României se
înfiintează un loc de serviciu maghiar pentru controlul traficului de
frontieră.
(3) Controlul traficului international de persoane care
ies de pe teritoriul României si intră pe teritoriul Republicii Ungare -
inclusiv controlul persoanelor participante la traficul international de mărfuri
- are loc pe teritoriul Republicii Ungare, într-un loc comun. În acest scop pe
teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român
pentru controlul traficului de frontieră.
(4) Programul de lucru al punctului de trecere a
frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.
(5) Pentru personalul de serviciu maghiar, teritoriul de
functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră,
existent pe teritoriul României, se extinde asupra:
a) încăperilor de serviciu desemnate,
încăperilor comune;
b) drumului public care duce de la frontiera de stat la
locul de serviciu;
c) benzilor de circulatie de control;
d) parcării de serviciu.
(6) Pentru personalul de serviciu român, teritoriul de
functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră,
existent pe teritoriul Republicii Ungare, se extinde asupra:
a) încăperilor de serviciu desemnate,
încăperilor comune;
b) drumului public care duce de la frontiera de stat la
locul de serviciu;
c) benzilor de circulatie ds control;
d) parcării de serviciu.
ARTICOLUL 9
(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru
traficul international de persoane si de mărfuri.
(2) Controlul traficului de persoane care ies. de pe
teritoriul Republicii Ungare si intră pe teritoriul României prin punctul
de trecere rutier de la Bors (Bors) - Artând are loc pe
teritoriul României, într-un loc comun. În acest scop pe teritoriul României se
înfiintează un loc de serviciu maghiar pentru controlul traficului de
frontieră.
(3) Controlul traficului international de persoane care
ies de pe teritoriul României si intră pe teritoriul Republicii Ungare are
loc pe teritoriul Republicii Ungare, într-un loc comun. In acest scop pe
teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român
pentru controlul traficului de frontieră.
(4) Controlul persoanelor participante la traficul
international de mărfuri la punctul de trecere a frontierei indicat la
alin. (1) are loc într-un loc comun de pe teritoriul Republicii Ungare. În
acest scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de
serviciu român pentru controlul traficului de frontieră.
(5) Programul de lucru al punctului de trecere a
frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.
(6) Pentru personalul de serviciu maghiar, teritoriul de
functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră,
existent pe teritoriul României, se extinde asupra:
a) încăperilor de serviciu desemnate,
încăperilor comune;
b) drumului public care duce de la frontiera de stat la
locul de serviciu;
c) benzilor de circulatie de control;
d) parcării de serviciu.
(7) Pentru personalul de serviciu român, teritoriul de
functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră,
existent pe teritoriul Republicii Ungare, se extinde asupra:
a) încăperilor de serviciu desemnate,
încăperilor comune;
b) drumului public care duce de la frontiera de stat la
locul de serviciu;
c) benzilor de circulatie de control si cabinelor de
serviciu aferente acestora, atât pe terminalul de iesire, cât si de intrare;
d) parcării de serviciu.
ARTICOLUL 10
(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru
traficul international de persoane.
(2) Controlul traficului international de persoane la
punctul de trecere a frontierei rutier Valea lui Mihai (Érmihályfalva) -
Nyirábrány are loc pe teritoriul Republicii Ungare, într-un loc comun. În acest
scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu
român pentru controlul traficului de frontieră.
(3) în cazul creării conditiilor necesare de
personal, tehnice si de infrastructură, părtile contractante
autorizează traficul international de mărfuri la punctul de trecere a
frontierei, până la limita unei greutăti totale de 3,5 tone, despre a
cărui introducere se va conveni pe cale diplomatică.
(4) Programul de lucru al punctului de trecere a
frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.
(5) Pentru personalul de serviciu român, teritoriul de
functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră
se extinde asupra:
a) încăperilor de serviciu desemnate,
încăperilor comune;
b) drumului public care duce de la frontiera de stat la
locul de serviciu;
c) benzilor de circulatie de control;
d) parcării de serviciu.
ARTICOLUL 11
(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru
traficul international de persoane.
(2) Controlul traficului international de persoane la
punctul de trecere a frontierei rutier Urziceni (Csánalos) - Vállaj are loc pe
teritoriul Republicii Ungare, într-un loc comun. În acest scop pe teritoriul
Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român pentru controlul
traficului de frontieră.
(3) In cazul creării conditiilor necesare de personal,
tehnice si de infrastructură, părtile contractante autorizează
traficul international de mărfuri la punctul de trecere a frontierei,
până la limita unei greutăti totale de 3,5 tone, despre a cărui
introducere se va conveni pe cale diplomatică.
(4) Programul de lucru al punctului de trecere a
frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.
(5) Pentru personalul de serviciu român, teritoriul de
functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră
se extinde asupra:
a) încăperilor de serviciu desemnate,
încăperilor comune;
b) drumului public care duce de la frontiera de stat la
locul de serviciu;
c) benzilor de circulatie de control;
d) parcării de serviciu.
ARTICOLUL 12
(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru
traficul international de persoane si de mărfuri.
(2) Controlul traficului de persoane care ies de pe
teritoriul Republicii Ungare si intră pe teritoriul României prin punctul
de trecere rutier Petea (Pete) - Csengersima are loc pe teritoriul României,
într-un loc comun. În acest scop pe teritoriul României se înfiintează un
loc de serviciu maghiar pentru controlul traficului de frontieră.
(3) Controlul traficului international de persoane care
ies de pe teritoriul României si intră pe teritoriul Republicii Ungare are
loc pe teritoriul Republicii Ungare, într-un loc comun. In acest scop pe
teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român
pentru controlul traficului de frontieră.
(4) Controlul persoanelor participante la traficul
international de mărfuri la punctul de trecere a frontierei indicat la
alin. (1) are loc într-un loc comun de pe teritoriul Republicii Ungare. În
acest scop pe teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de
serviciu român pentru controlul traficului de frontieră.
(5) Programul de lucru al punctului de trecere a
frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.
(6) Pentru personalul de serviciu maghiar, teritoriul de
functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră,
existent pe teritoriul României, se extinde asupra:
a) încăperilor de serviciu desemnate,
încăperilor comune;
b) drumului public care duce de la frontiera de stat la
locul de serviciu;
c) benzilor de circulatie de control;
d) parcării de serviciu.
(7) Pentru personalul de serviciu român, teritoriul de
functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de frontieră,
existent pe teritoriul Republicii Ungare, se extinde asupra:
a) încăperilor de serviciu desemnate,
încăperilor comune;
b) drumului public care duce de la frontiera de stat la
locul de serviciu;
c) benzilor de circulatie de control si cabinelor de
serviciu aferente acestora, atât pe terminalul de iesire, cât si de intrare;
d) parcării de serviciu.
ARTICOLUL 13
(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru
traficul international de persoane, cu exceptia traficului de autobuze, precum si pentru traficul international de mărfuri,
până la limita de greutate totală de 7,5 tone.
(2) Controlul traficului international de persoane la
punctul de trecere a frontierei rutier Săcuieni (Székelyhîd) - Létavértes
are loc pe teritoriul Republicii Ungare, într-un loc comun. În acest scop pe
teritoriul Republicii Ungare se înfiintează un loc de serviciu român
pentru controlul traficului de frontieră.
(3) Programul de lucru al punctului de trecere a
frontierei este zilnic de la ora 6,00 la ora 22,00, ora locală.
(4) Pentru personalul de serviciu român,
teritoriul de functionare la locul de serviciu pentru controlul traficului de
frontieră se extinde asupra:
a) încăperilor de serviciu desemnate,
încăperilor comune;
b) drumului public care duce de la frontiera de stat la
locul de serviciu;
c) unei benzi de circulatie de control pe fiecare sens si
cabinelor de serviciu;
d) parcării de serviciu.
(5) în cazul creării conditiilor de
infrastructură necesare, părtile contractante autorizează
traficul de autobuze, asupra căruia se informează reciproc pe cale
diplomatică.
ARTICOLUL 14
În privinta art. 4-13 si 20,
încăperile de serviciu necesare în statul da teritoriu personalului de
serviciu al statului vecin sunt asigurate de statul de teritoriu, iar asupra
utilizării si conditiilor de exploatare a acestora organele competente ale
părtilor contractante vor conveni cu administratorul în cadrul unui
contract de drept civil.
CAPITOLUL III
Puncte de trecere a frontierei feroviare
ARTICOLUL 15
(1) Punctul de trecere a frontierei este
deschis pentru traficul international de persoane si de mărfuri.
(2) Programul de lucru al punctului de trecere a
frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.
ARTICOLUL 16
(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru
traficul international de persoane si de mărfuri.
(2) Programul de lucru al punctului de trecere a
frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.
ARTICOLUL 17
(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru
traficul international de persoane si de mărfuri.
(2) Programul de lucru al punctului de trecere a
frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.
ARTICOLUL 18
(1) Punctul de trecere a frontierei este
deschis pentru traficul international de persoane si de mărfuri.
(2) Programul de lucru al punctului de trecere a
frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.
ARTICOLUL 19
(1) Punctul de trecere a frontierei este deschis pentru
traficul international de persoane si de mărfuri.
(2) Programul de lucru al punctului de trecere a
frontierei este zilnic de la ora 00,00 la ora 24,00.
CAPITOLUL IV
Punctul comun de contact
ARTICOLUL 20
(1)
În scopul dezvoltării colaborării internationale si schimbului de
informatii dintre organele de politie, la punctul de trecere a frontierei
Bors-Ártánd, părtile contractante mentin în functionare, pe teritoriul
Republicii Ungare, un punct comun de contact, cu un program zilnic de la ora
00,00 la ora 24,00.
(2) Pentru persoanele de serviciu desemnate de
autoritatea competentă română, teritoriul de functionare la punctul
comun de contact se extinde asupra:
- drumului de la frontiera de stat comună la locul
de serviciu pentru controlul traficului de frontieră, în scopul
deplasării la serviciu;
- încăperilor de serviciu desemnate la punctul de
trecere a frontierei, precum si încăperilor grupurilor sociale aferente
acestora;
- parcării de serviciu desemnate.
(3) Părtile contractante asigură conditiile
pentru persoanele de serviciu, necesare functionării punctului comun de
contact. Persoanele desemnate să-si îndeplinească serviciul la
punctul comun de contact trebuie să cunoască bine-în scris si verbal
- limba oficială a statului vecin.
ARTICOLUL 21
În punctul comun de contact, partea
contractantă maghiară asigură încăperile de serviciu,
permitând totodată părtii contractante române exploatarea
echipamentelor de telecomunicatii si operare a datelor instalate de aceasta si
realizarea racordurilor necesare la reteaua corespunzătoare a părtii
contractante române, având în vedere cele prevăzute la art. 27 din
Conventie.
ARTICOLUL 22
(1) În scopul facilitării colaborării si
schimbului de informatii dintre organele de control al traficului de
frontieră si cele de combatere a infractionalitătii, părtile
contractante pot înfiinta noi puncte comune de contact. Despre aceasta, precum
si despre sarcinile locurilor de serviciu comune deja functionale si
lărgirea sferei de atributii a organelor care colaborează se va
conveni pe calea schimbului de note diplomatice în scopul aplicării
prezentului acord.
(2) Functionarii care îsi îndeplinesc serviciul în
punctul comun de contact îsi desfăsoară activitatea pe baza
prevederilor cuprinse în prezentul acord si a legislatiei interne în vigoare.
Functionarii pot primi dispozitii exclusiv de la sefii lor ierarhici.
(3) Structura organizatorică si regulile de
functionare de detaliu ale punctului comun de contact sunt cuprinse în
regulamentul de organizare si functionare, aprobat de autoritătile
competente ale părtilor contractante.
ARTICOLUL 23
(1) În punctele comune de contact persoanele de serviciu
desemnate de autoritătile competente ale părtilor contractante
colaborează în concordantă cu legislatia lor internă în vigoare:
a) în schimbul de informatii care
interesează controlul traficului de frontieră, analiza acestora,
simplificarea, fluidizarea si armonizarea traficului de frontieră;
b) pentru desfăsurarea unui schimb direct de
informatii în vederea prevenirii, descoperirii si împiedicării delictelor
de trecere a frontierei;
c) în coordonarea interventiilor împotriva imigratiei
ilegale si actiunilor ilegale conexe;
d) la cerere, oferă sprijin în vederea
solutionării problemelor apărute în cursul aplicării
acordului de readmisie în vigoare încheiat între părtile contractante.
(2) În scopul realizării colaborării stabilite
la alin. (1), precum si la art. 22 alin. (1), persoanele de serviciu, în
conformitate cu sarcinile si competentele lor, desfăsoară un schimb
permanent si direct de informatii, îndeosebi în următoarele domenii:
- descoperirea delictelor legate de trecerea frontierei
sau săvârsite în apropierea frontierei si a altor fapte ilegale, analiza
si evaluarea comportamentelor ilegale tipice si a noilor metode de săvârsire;
- experienta generală acumulată în cursul
controalelor traficului de frontieră si tendintele care se pot stabili pe
baza acesteia;
- experienta activitătii în cadrul punctului comun
de contact;
- evenimente probabile mai importante, cu impact asupra
traficului de frontieră (de exemplu, obstacole mai mari de circulatie),
manifestări deosebite, cresterea intensă, de durată, a
traficului de persoane, măsurile speciale care influentează traficul
de frontieră;
- legislatia internă ce interesează obiectul
prezentului acord, precum si modificările acesteia.
(3) Părtile contractante:
a) în scopul mentinerii unei legături permanente:
- desemnează persoanele de serviciu responsabile cu
mentinerea legăturii;
- trimit experti si fac schimb de experientă în scopul
dezvoltării colaborării reglementate prin prezentul acord;
b) în domeniul pregătirii si perfectionării:
- efectuează schimb de experientă asupra
metodelor de control si supraveghere a traficului de frontieră;
- oferă sprijin în pregătirea profesională
si privind limbile străine a personalului de serviciu al celeilalte
părti contractante;
- sprijină perfectionarea
specialistilor lor în cadrul unor manifestări, întâlniri de lucru,
programe de perfectionare comune.
ARTICOLUL 24
(1) Persoanele de serviciu, precum si reprezentantii
desemnati ai organelor pentru combaterea infractionalitătii (denumiti în
continuare functionari) ai părtilor contractante îsi
desfăsoară activitatea în locul comun si răspund în cel mai
scurt timp posibil la solicitarea functionarului celeilalte părti
contractante.
(2) Referitor la modul de rezolvare a
solicitărilor, în ceea ce priveste protectia datelor personale si a
informatiilor furnizate, vor fi aplicate prevederile Acordului dintre Guvernul
României si Guvernul Republicii Ungare privind readmisia cetătenilor
proprii si a altor persoane, semnat la Bucuresti la 10 decembrie 2001, iar în
privinta protectiei datelor personale si a informatiilor de natură
penală, vor fi aplicate prevederile Acordului dintre Guvernul României si
Guvernul Republicii Ungare de cooperare în domeniul combaterii crimei
organizate, terorismului si a traficului ilicit de droguri, semnat la Budapesta
la 19 februarie 1997.
(3) În sensul prezentului acord, autorităti
competente pentru combaterea infractionalitătii sunt cele autorizate
să ducă la îndeplinire sarcini de prevenire si combatere a
infractionalitătii, conform normelor de drept interne ale părtilor
contractante:
- din partea României: Politia de Frontieră
Română;
- din partea Republicii Ungare: Grănicerii
Republicii Ungare, Garda Financiară si Vamală.
CAPITOLUL V
Dispozitii finale
ARTICOLUL 25
(1) Părtile contractante
asigură protectia bazelor de date comunitare si unionale accesibile doar
uneia dintre părtile contractante. Partea contractantă căreia nu
i se permite accesul dă posibilitate celeilalte părti contractante
să utilizeze liniile protejate si să aplice regulile de
sigurantă pe teritoriul propriului stat.
(2) Diferendele rezultate din interpretarea sau aplicarea
prezentului acord vor fi solutionate de părtile contractante în cadrul
Comisiei mixte româno-ungare de trafic de frontieră, pe calea
negocierilor, iar în caz de nereusită, pe cale diplomatică.
(3) Aplicarea prezentului acord poate fi
suspendată temporar, în totalitate sau partial, de oricare parte
contractantă, pentru executarea obligatiilor asumate în acordurile
internationale si a altor obligatii juridice internationale, precum si din
motive de ordine publică, de sigurantă publică ori de
sănătate publică. Asupra introducerii sau revocării unei
asemenea măsuri cealaltă parte contractantă trebuie
informată fără întârziere, pe cale diplomatică.
Suspendarea, respectiv încetarea suspendării, în situatiile care
reclamă măsuri imediate, produce efecte începând cu primirea notei
verbale, iar în celelalte cazuri produce efecte în a 15-a (cincisprezecea) zi
după primirea notei verbale.
ARTICOLUL 26
(1) Prezentul acord se încheie pentru o perioadă
nedeterminată. Prezentul acord trebuie aprobat în conformitate cu
legislatia internă a statelor părtilor contractante si asupra
aprobării părtile contractante se înstiintează reciproc pe cale
diplomatică.
(2) Prezentul acord intră în vigoare în cea de-a
15-a zi de la data primirii ultimei note diplomatice prin care se comunică
aprobarea, acordul aplicându-se provizoriu începând cu data aderării
României la Uniunea Europeană, 1 ianuarie 2007.
(3) Începând cu ziua intrării în vigoare a
prezentului acord îsi încetează valabilitatea Acordul dintre Guvernul
României si Guvernul Republicii Ungare privind aplicarea Conventiei dintre
România si Republica Ungară privind controlul traficului de frontieră
rutier si feroviar, semnat la Bucuresti la 27 aprilie 2004.
(4) Prezentul acord poate fi denuntat în scris de oricare
dintre părtile contractante, pe cale diplomatică. Prezentul acord îsi
încetează valabilitatea în a 30-a (treizecea) zi de la primirea
comunicării privind denuntarea.
(5) În cazul suspendării aplicării Conventiei,
se suspendă si aplicarea prezentului acord.
(6) În cazul încetării valabilitătii Conventiei,
îsi μlerde valabilitatea si prezentul acord.
Semnat la Bucuresti la 21 decembrie 2006, în două
exemplare originale, în limbile română si maghiară, toate textele
fiind egal autentice.
|
Pentru Guvernul României, Vasile Blaga, ministrul administratiei si internelor |
Pentru Guvernul Republicii Ungare, dr. Janos Terenyi, ambasador extraordinar si plenipotentiar al Republicii
Ungare la Bucuresti |
GUVERNUL ROMÂNIEI
privind reglementarea actiunilor specifice aferente finantării
asistentei din cadrul politicii nationale de cooperare internatională
pentru dezvoltare
În temeiul arL
108 din Constitutia României, republicată, si al art. 3 alin. (2) din
Legea nr. 404/2006 privind finantarea asistentei pentru dezvoltare din cadrul
politicii nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare,
Guvernul României adoptă prezenta hotărâre.
CAPITOLUL I
Dispozitii generale
Art. 1.
- (1) Prezenta hotărâre reglementează actiunile specifice aferente
finantării asistentei din cadrul politicii nationale de cooperare
internatională pentru dezvoltare.
(2) Prezenta hotărâre stabileste:
a) formele de asistentă pentru dezvoltare acordate
de România în cadrul politicii nationale de cooperare internatională
pentru dezvoltare;
b) procedurile de programare si acordare a asistentei
pentru dezvoltare;
c) cadrul institutional al gestionării resurselor
aferente implementării asistentei pentru dezvoltare.
Art. 2.
- (1) Prioritătile geografice si sectoriale ale asistentei pentru
dezvoltare sunt cele prevăzute de Strategia natională privind
politica de cooperare internatională pentru dezvoltare, aprobată prin
Hotărârea Guvernului nr. 703/2006.
(2) Statele
partenere beneficiare de asistenta pentru dezvoltare, precum si fondurile
financiare alocate în acest scop începând cu anul 2008 se stabilesc de
Ministerul Afacerilor Externe si sunt aprobate pe bază de memorandum de
Guvernul României, în conformitate cu angajamentele asumate de România pe plan
international în materie de finantare si eficacitate a asistentei pentru dezvoltare,
cu exceptia asistentei financiare acordate sub forma reducerii/stergerii
datoriilor tărilor debitoare României, care intră sub incidenta Legii
nr. 29/1994 privind autorizarea Guvernului de a aproba negocierea în vederea
recuperării creantelor României provenite din activitatea de comert
exterior si cooperare economică internatională, derulată înainte
de 31 decembrie 1989, cu modificările ulterioare, si a Ordonantei
Guvernului nr. 59/1994 privind reglementarea operatiunilor de import-export
care se derulează prin cliring, barter si cooperare economică
internatională în baza acordurilor comerciale si de plăti
guvernamentale, republicată.
Art. 3.
- în sensul prezentei hotărâri, termenii si expresiile mentionate mai jos
au următoarea semnificatie:
a) asistentă pentru dezvoltare - suma
resurselor alocate de România statelor partenere în conformitate cu criteriile
de clasificare a asistentei oficiale pentru dezvoltare elaborate de Comitetul
Asistentă pentru Dezvoltare din cadrul Organizatiei pentru Cooperare si Dezvoltare
Economică (denumită în continuare OCDE);
b) obiectivele de dezvoltare ale mileniului - cele
8 obiective adoptate cu ocazia Summitului Mileniului, găzduit în
septembrie 2000 de Organizatia Natiunilor Unite, de realizat până în 2015,
cu tintele si indicatorii aferenti, după cum urmează: eradicarea
sărăciei extreme si a foametei; realizarea educatiei primare
universale; promovarea egalitătii sanselor si împuternicirea femeilor;
reducerea mortalitătii infantile; îmbunătătirea
sănătătii materne; combaterea HIV/SIDA, a malariei si a altor
boli infectioase; asigurarea durabilitătii mediului înconjurător;
dezvoltarea unui parteneriat global pentru dezvoltare;
c) stat partener - statul tert în curs de
dezvoltare, cu venit mic sau mediu, căruia România îi acordă
asistentă pentru dezvoltare si care este catalogat la data acordării
asistentei drept potential beneficiar de asistentă oficială pentru
dezvoltare de către Comitetul Asistentă pentru Dezvoltare din cadrul
OCDE;
d) stat partener prioritar - stat partener
căruia România îi acordă asistentă pentru dezvoltare pe o
bază multianuală si pentru care volumul de asistentă pentru
dezvoltare oferită depăseste valoarea în lei a sumei de 5 milioane de
euro anual, calculată la cursul Băncii Nationale a României la data
planificării bugetare a asistentei;
e) ster partener in atentie - stat partener
căruia România îi acordă asistentă pentru dezvoltare pentru un
proiect specific si/sau anuală si pentru care volumul de asistentă
pentru dezvoltare oferită excedează valoarea în lei a sumei de 1
milion de euro, dar nu depăseste valoarea în lei a sumei de 5 milioane de
euro anual, sume calculate la cursul Băncii Nationale a României la data
planificării bugetare a asistentei;
f) stat donator- stat care acordă
asistentă pentru dezvoltare;
g) ajutorul bugetar direct - transferul de fonduri
direct la bugetul unui stat partener, realizat în vederea sustinerii unui
program guvernamental urmărind cresterea economică, reducerea
sărăciei, ajustarea fiscală, întărirea institutională,
precum si a proceselor bugetare, acestea fiind cheltuite conform sistemelor de
gestiune financiară ale statului partener;
h) proiecte de asistentă pentru dezvoltare - setul
de activităti interconectate, vizând realizarea unui obiectiv punctual de
dezvoltare;
i) programe de asistentă pentru dezvoltare - setul
de activităti si proiecte de asistentă pentru dezvoltare,
interconectate, urmărind consolidarea unui sector specific de interes al
statului partener;
j) înfrătire institutională - setul de
activităti destinate întăririi capacitătii administrative si
judiciare a statelor partenere realizate în colaborare cu institutiile publice
românesti.
CAPITOLUL II
Forme de asistentă pentru dezvoltare
Art. 4.
- Guvernul României utilizează următoarele modalităti de distributie
a asistentei pentru dezvoltare:
a) asistentă bilaterală - include
activitătile de cooperare pentru dezvoltare derulate direct între România
si statul partener ori indirect, prin intermediul unor contractanti;
b) asistentă trilaterală - include asistentă
pentru dezvoltare prin cofinantare acordată de România statului partener
în cooperare cu alt stat donator si/sau o organizatie internatională;
c) asistentă multilaterală - include
contributii către organizatiile internationale care îsi derulează activitatea,
partial sau integral, în aria cooperării pentru dezvoltare si aflate pe
lista Comitetului Asistentă pentru Dezvoltare al OCDE, precum si
către fondurile special administrate de acestea, în acest scop.
Art. 5.
- Guvernul României acordă următoarele tipuri de asistentă
pentru dezvoltare:
a) asistentă tehnică, prin furnizarea de
servicii, produse si lucrări în vederea sustinerii procesului de
dezvoltare a statului partener - inclusiv pregătirea si formarea
profesională, furnizarea rezultatelor unor activităti de cercetare,
burse de studii si stagii de practică, implementarea de proiecte de
înfrătire institutională si alte initiative de recrutare, formare si
plasare de voluntari;
b) asistentă financiară - asistenta
financiară nerambursabilă si stergerea si/sau reducerea datoriilor
tărilor în curs de dezvoltare fată de România;
c) asistentă umanitară - asistenta de
urgentă acordată statelor în caz de dezastre si conflicte armate
prelungite, cu scopul atenuării consecintelor asupra victimelor, inclusiv
asistenta oferită în procesul de tranzitie de la o situatie de criză
umanitară către procesele de reabilitare sau reconstructie timpurie;
d) asistentă pentru educatie pentru dezvoltare si
activitătile de constientizare publică în domeniul dezvoltării -
activitătile desfăsurate în scopul promovării unei mai bune
întelegeri în rândul populatiei sau al unor categorii specifice ale populatiei,
a problemelor cu care se confruntă statele în curs de dezvoltare, a
necesitătii solidarizării cu acestea, ce contribuie la crearea unui
sprijin puternic, din partea opiniei publice, în favoarea politicii nationale
de cooperare internatională pentru dezvoltare.
CAPITOLUL III
Cadrul de programare a asistentei pentru dezvoltare
Art. 6.
- (1) Ministerul Afacerilor Externe elaborează o strategie de tară
pentru fiecare stat partener prioritar.
(2) Strategia de tară reprezintă
documentul-cadru de programare întocmit prin consultări cu Guvernul
statului partener prioritar, autoritătile competente române si societatea
civilă.
(3) Strategia de tară se adoptă de către
Guvernul României prin memorandum elaborat si înaintat spre aprobare de
către Ministerul Afacerilor Externe.
(4) Strategia de tară contine următoarele
elemente:
a) descrierea obiectivelor politicii României în materie
de cooperare pentru dezvoltare;
b) descrierea obiectivelor statului partener prioritar în
materie de reducere a sărăciei si dezvoltare;
c) analiza situatiei politice, economice si sociale din
statul partener prioritar;
d) descrierea activitătilor trecute si prezente ale
principalilor donatori;
e) strategia de răspuns a României la problemele de
dezvoltare ale statului partener prioritar, prin identificarea unui număr
limitat de sectoare de interventie;
f) obiectivele globale ale cooperării pentru
perioada de aplicabilitate a Strategiei de tară;
g) alocarea resurselor financiare pentru fiecare sector
de interventie;
h) obiectivele specifice, rezultatele asteptate si
indicatorii de performantă pentru fiecare sector de interventie;
i) modalitătile de integrare a tematicilor
orizontale, cu aplicabilitate în mai multe sectoare de interventie;
j) programele avute în vedere pentru atingerea
obiectivelor, precum si tipurile si instrumentele de asistentă.
(5) Strategia de tară se aprobă pentru un
interval de minimum 3 ani, în functie de ciclul bugetar al statului partener si
de strategiile acestuia de dezvoltare si reducere a sărăciei.
(6) Strategia de tară se revizuieste periodic, pe
baza evaluărilor rezultatelor obtinute.
Art. 7.
- (1) Guvernul României, la propunerea Ministerului Afacerilor Externe, încheie
acorduri de cooperare pentru dezvoltare cu fiecare stat partener prioritar.
Acordurile de cooperare pentru dezvoltare sunt initiate si negociate de
Ministerul Afacerilor Externe în colaborare cu autoritătile publice din
România, cu atributii în domeniile prevăzute la art. 2 din Legea nr.
404/2006 privind finantarea asistentei pentru
dezvoltare din cadrul politicii nationale de cooperare
internatională pentru dezvoltare.
(2) Acordurile de cooperare pentru dezvoltare reprezintă
instrumentul juridic de reglementare a asistentei pentru dezvoltare acordate de
Guvernul României.
(3) Acordurile de cooperare pentru dezvoltare stabilesc
termenii si conditiile generale de acordare de asistentă pentru
dezvoltare, inclusiv domeniile de interventie, alocările financiare
indicative, precum si drepturile si obligatiile părtilor.
(4) Acordurile de cooperare pentru dezvoltare au caracter
de contract de stat si nu intră sub incidenta Legii nr. 590/2003 privind
tratatele.
Art. 8.
- (1) Ministerul Afacerilor Externe încheie memorandumuri de întelegere cu
toate statele partenere, cu exceptia statelor debitoare României care
beneficiază de asistenta financiară pentru dezvoltare acordată
sub forma reducerii/stergerii datoriilor care intră sub incidenta Legii
nr. 29/1994, cu modificările ulterioare, si a Ordonantei Guvernului nr.
59/1994, republicată.
(2) Pentru statele partenere prioritare memorandumurile
de întelegere au la bază acordurile de cooperare pentru dezvoltare si
stabilesc elementele specifice de asistentă (sprijin bugetar, proiecte,
programe) agreate între cele două părti.
(3) Pentru statele partenere în atentie si celelalte
state partenere memorandumurile de întelegere stabilesc atât cadrul general de
cooperare, cât si elementele specifice de asistentă (sprijin bugetar,
proiecte, programe) agreate între cele două părti.
Art. 9.
- (1) Ministerul Afacerilor Externe elaborează Planul anual de actiune
care cuprinde:
a) descrierea activitătilor planificate pentru
următoarele 12 luni;
b) calendarul activitătilor si îndeplinirii
obiectivelor;
c) bugetul pentru anul fiscal aferent.
(2) Planul anual de actiune fundamentează
memorandumurile de întelegere si este aprobat prin ordin al ministrului
afacerilor externe, la propunerea secretarului de stat responsabil pentru
politica natională de cooperare internatională pentru dezvoltare din
cadrul Ministerului Afacerilor Externe.
Art. 10.
- (1) Ministerul Afacerilor Externe elaborează o strategie
multianuală pentru acordarea de asistentă pentru dezvoltare în plan
multilateral.
(2) Strategia prevăzută la alin. (1) contine
următoarele elemente:
a) descrierea obiectivelor politicii României în materie
de cooperare pentru dezvoltare;
b) analiza globală a activitătilor tematice si
geografice desfăsurate de organizatiile internationale în materie de
dezvoltare;
c) strategia de cooperare multilaterală pentru
dezvoltare a României prin identificarea unor priorităti de actiune;
d) alocarea resurselor financiare între priorităti.
(3) Strategia pentru asistentă multilaterală se
aprobă pentru un interval de minimum 3 ani, în functie de calendarul
atingerii obiectivelor de dezvoltare ale mileniului.
(4) Strategia
pentru asistentă multilaterală se adoptă de Guvernul României,
prin memorandumul elaborat si înaintat spre aprobare de Ministerul Afacerilor
Externe.
CAPITOLUL IV
Proceduri de acordare a asistentei pentru dezvoltare
Art. 11.
- Achizitiile de produse, servicii si lucrări finantate în cadrul
politicii nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare se
realizează potrivit prevederilor legale române în materie de achizitii
publice.
Art. 12.
- (1) Ministerul Afacerilor Externe cofinantează proiecte si programe de
asistentă pentru dezvoltare atunci când acestea sunt în concordantă
cu Strategia de tară în cazul statelor partenere prioritare sau dacă
aceste proiecte si programe fac obiectul unui memorandum de întelegere specific încheiat între toate statele donatoare cofinantatoare si
statul partener.
(2) Memorandumul de întelegere specific stabileste drepturile
si obligatiile părtilor, legislatia aplicabilă pentru atribuirea
contractelor de achizitie publică si metodologia, termenii si conditiile
de efectuare a plătilor.
Art. 13.
- Ministerul Afacerilor Externe contribuie la finantarea de proiecte si programe
de asistentă pentru dezvoltare implementate de organizatii multilaterale,
inclusiv fondurile administrate de acestea, în sprijinirea dezvoltării
statelor partenere, cu respectarea prioritătilor stabilite prin
strategiile de tară, în cazul în care există, sau pe baza
memorandumurilor de fntelegere încheiate cu fiecare stat partener.
Art. 14.
- Ministerul Afacerilor Externe contribuie la finantarea bugetului
organizatiilor internationale, inclusiv fondurile administrate de acestea, în
baza strategiei multianuale pentru asistentă multilaterală.
Art. 15.
- Finantarea contributiilor prevăzute la art. 13 si 14 se realizează
în baza unui memorandum de întelegere încheiat între Ministerul Afacerilor
Externe si organizatia internatională în cauză sau conform procedurilor
legale aplicabile organizatiei internationale respective.
Art. 16.
- (1) Organizatiile neguvernamentale din România pot beneficia de finantare
nerambursabilă din bugetul Ministerului Afacerilor Externe destinat
finantării asistentei pentru dezvoltare pentru:
a) derularea de programe si proiecte de cooperare pentru
dezvoltare în statele partenere; si
b) derularea de activităti de educatie pentru
dezvoltare si constientizare publică în domeniul dezvoltării.
(2) Finantarea activitătilor organizatiilor neguvernamentale
din România se realizează în baza Legii nr. 350/2005 privind regimul
finantărilor nerambursabile din fonduri publice alocate pentru
activităti nonprofit de interes general.
Art. 17.
- (1) Ajutorul bugetar direct, la nivel general si/sau sectorial, se
acordă statului partener care îndeplineste cumulativ următoarele
conditii:
a) demonstrează un angajament credibil în vederea
reducerii sărăciei si a cresterii economice, angajament reflectat
prin existenta unei strategii de reducere a sărăciei sau a unui
document echivalent acesteia;
b) există un sistem stabil de gestiune
macroeconomică si un mediu propice dezvoltării sectorului privat;
c) calitatea gestionării finantelor publice este
adecvată si/sau există un program credibil de reformă a sistemului
de gestionare a finantelor publice;
d) există un cadru sectorial de cheltuieli pe termen
mediu si un buget anual;
e) se realizează coordonarea sectorială între
donatori sub conducerea Grupului Băncii Mondiale sau a Comisiei Europene
cu participarea activă a Guvernului tării partenere;
f) există un set de indicatori de performantă
pentru evaluarea progresului în realizarea obiectivelor politicilor nationale.
(2) Ajutorul bugetar direct se acordă prin
memorandumurile de întelegere prevăzute la art. 8, încheiate de Ministerul
Afacerilor Externe cu fiecare stat partener.
Art. 18.
- (1) Ministerul Afacerilor Externe cofinantează din bugetul destinat
finantării asistentei pentru dezvoltare proiecte de înfrătire
institutională cu statele partenere în domenii în care experienta României
este relevantă si de interes pentru acestea.
(2) Proiectele de înfrătire institutională
prevăzute la alin. (1) îndeplinesc cumulativ următoarele conditii:
a) se încadrează în prioritătile stabilite în
Strategia de tară sau memorandumul de întelegere aferente tărilor
partenere;
b) se desfăsoară pe baza unor termeni de
referintă clari care specifică obiectivele proiectului,
activitătile avute în vedere, obligatiile statului partener si rezultatele
asteptate;
c) fac obiectul unui acord între Ministerul Afacerilor
Externe si institutia publică română în cauză prin care sunt
stabiliti termenii sl conditiile
proiectului de înfrătire institutională;
d) se desfăsoară pe o perioadă
cuprinsă între 30 de zile si 36 de luni.
(3) Proiectele de înfrătire institutională se
aprobă prin memorandumurile de întelegere prevăzute la art. 8,
încheiate de Ministerul Afacerilor Externe cu fiecare stat partener.
Art. 19.
- Furnizarea de asistentă umanitară este un act de vointă
unilaterală a Guvernului României si este acordată direct statului în
cauză ori indirect, prin intermediul unei organizatii internationale cu
competente în domeniu sau al unui fond autonom gestionat de o organizatie
internatională de profil ori al unui fond constituit în mod special pentru
a răspunde necesitătilor unei crize umanitare sau al unor organizatii
neguvernamentale române si/sau străine.
Art. 20.
- Pentru acordarea de asistentă umanitară prin intermediul
organizatiilor neguvernamentale, române sau străine, este necesar ca acestea
să îndeplinească următoarele criterii:
a) să aibă experientă în domeniul
asistentei umanitare;
b) să cunoască circumstantele si specificul
local;
c) să facă dovada detinerii mijloacelor de
furnizare rapidă si eficientă a asistentei umanitare către persoanele
sinistrate.
Art. 21.
- (1) Ministerul Afacerilor Externe înaintează, prin memorandum, spre
aprobare Guvernului României propunerile de finantare de asistentă
umanitară.
(2) Ministerul Afacerilor Externe asigură finantarea
asistentei umanitare din bugetul destinat asistentei pentru dezvoltare prin
ordin al ministrului afacerilor externe.
Art. 22.
- Actiunile de reducere/stergere a datoriilor statelor în curs de dezvoltare
fată de România provenite din activitatea de comert exterior si cooperare
economică internatională, derulată înainte de 31 decembrie 1989,
precum si â celor evidentiate în conturile de cliring, bartersi cooperare
economică internatională, în baza acordurilor comerciale si de
plăti guvernamentale, se realizează potrivit prevederilor legale
române în vigoare.
CAPITOLUL V
Cadrul institutional
Art. 23.
- Ministerul Afacerilor Externe este coordonatorul politicii nationale de
cooperare internatională pentru dezvoltare.
Art. 24.
- Atributiile Ministerului Afacerilor Externe în problematica reglementată
prin prezenta hotărâre sunt cele prevăzute de Strategia
natională privind politica natională de cooperare internatională
pentru dezvoltare.
Art. 25.
- Aprobarea proiectelor si programelor de asistentă pentru dezvoltare se
realizează prin ordin al ministrului afacerilor externe în baza Strategiei
nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare, a
prioritătilor geografice si a fondurilor financiare aprobate în acest scop
de Guvernul României si cu respectarea prevederilor prezentului act normativ.
Art. 26.
- (1) Activitatea privind evaluarea tehnică si financiară a
proiectelor si programelor de asistentă pentru dezvoltare se
realizează de către Oficiul de Plăti si Contractare PHARE (OPCP)
din cadrul Ministerului Economiei si Finantelor.
(2) OPCP asigură:
a) organizarea procedurilor de achizitie publică, a
selectiilor publice de proiecte si a licitatiilor;
b) evaluarea si avizarea proiectelor si programelor în
vederea aprobării;
c) contractarea proiectelor si programelor;
d) raportarea privind situatia financiară a
proiectelor si programelor;
e) evaluarea stadiului îndeplinirii obiectivelor
proiectelor si programelor;
f) auditarea conturilor de către autoritătile
nationale.
(3) Modalitătile specifice de colaborare între
Ministerul Afacerilor Externe si Ministerul Economiei si Finantelor se
stabilesc printr-un memorandum de întelegere încheiat între cele două
institutii în termen de 30 de zile de la data intrării în vigoare a
prezentei hotărâri.
ArL 27.
- In termen de 30 de zile de la data intrării în vigoare a prezentei
hotărâri, ministrul afacerilor externe si ministrul economiei si
finantelor aprobă prin ordin comun manualul de implementare a asistentei
pentru dezvoltare.
Art. 28.
- (1) în procesul de elaborare, implementare si coordonare a politicii
nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare, Ministerul
Afacerilor Externe colaborează cu autoritătile administratiei publice
din România, cu atributii în domeniile prevăzute la art. 2 din Legea nr.
404/2006.
(2) Institutiile publice române propun Ministerului
Afacerilor Externe proiecte si programe de asistentă pentru dezvoltare în
vederea finantării acestora din bugetul destinat finantării politicii
nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare. Activitătile
de implementare a acestor proiecte si programe sunt realizate de institutiile
publice române initiatoare.
Art. 29.
- (1) La data intrării în vigoare a prezentei hotărâri se
înfiintează, în subordinea Consiliului interministerial pentru relatii
externe si afaceri europene prevăzut în anexa nr. 2 la Hotărârea
Guvernului nr. 750/2005 privind constituirea consiliilor interministeriale
permanente, Comisia pentru cooperare economică si dezvoltare
internatională, denumită în continuare Comisia.
(2) Comisia prevăzută la alin. (1) este
alcătuită din câte un reprezentant, la nivel de secretar de
stat/presedinte, din următoarele institutii:
a) Ministerul Educatiei, Cercetării si Tineretului;
b) Ministerul Economiei si Finantelor;
c) Ministerul Mediului si Dezvoltării Durabile;
d) Ministerul Transporturilor;
e) Ministerul Sănătătii Publice;
f) Ministerul pentru întreprinderi Mici si Mijlocii,
Comert, Turism si Profesii Liberale;
g) Ministerul Justitiei;
h) Ministerul Culturii si Cultelor; i) Ministerul
Internelor si Reformei Administrative; j) Ministerul Comunicatiilor si
Tehnologiei Informatiei; k) Ministerul Agriculturii si Dezvoltării Rurale;
I) Ministerul
Dezvoltării, Lucrărilor Publice si Locuintelor; m) Ministerul Muncii,
Familiei si Egalitătii de Sanse; n) Agentia Română pentru Investitii
Străine; o) Autoritatea Natională pentru Reglementarea si
Monitorizarea Achizitiilor Publice;
p) Agentia pentru Strategii Guvernamentale.
(3) Ministerul Afacerilor Externe este reprezentat în
Comisie de secretarul de stat pentru afaceri europene si de seful
Departamentului pentru Relatiile cu Românii de Pretutindeni.
(4) Comisia actionează în calitate de:
a) forum de analiză, dezbatere si planificare
interinstitutională a problematicilor decurgând din gestionarea relatiei
Guvernului României cu OCDE; si
b) forum de analiză, dezbatere si planificare
interinstitutională a problematicilor privind realizarea politicii
nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare.
(5) Ministerul Afacerilor Externe asigură
presedintia si secretariatul Comisiei. Sedintele în plen se convoacă de
către Ministerul Afacerilor Externe ori de câte ori este necesar.
(6) Regulamentul de organizare si functionare a Comisiei
se elaborează de către Comisie, se aprobă în prima sedintă
a acesteia si constituie anexă la Regulamentul privind organizarea si
functionarea Consiliului interministerial pentru relatii externe si afaceri
europene.^
Art. 30.
- (1) în termen de 60 de zile de la data intrării în vigoare a prezentei
hotărâri se înfiintează Consiliul pentru cooperare pentru dezvoltare,
denumit în continuare Consiliul.
(2) Consiliul prevăzut la alin. (1) este organism
fără personalitate juridică, functionează pe lângă
Ministerul Afacerilor Externe, are un rol consultativ si asistă Ministerul
Afacerilor Externe în definirea si implementarea politicii nationale de
cooperare internatională pentru dezvoltare.
(3) Consiliul este compus din reprezentanti ai
Ministerului Afacerilor Externe, invitati ai organizatiilor membre ale
Federatiei Organizatiilor Neguvernamentale pentru Dezvoltare din România,
precum si invitati din partea Parlamentului României, societătii civile,
institutiilor de cult, mediului academic, mediului de afaceri, sindicatelor,
mediei si alte persoane fizice sau juridice care îsi desfăsoară activitatea
în domeniul asistentei pentru dezvoltare.
(4) Ministerul Afacerilor Externe asigură
presedintia si secretariatul Consiliului. Sedintele în plen se convoacă de
către Ministerul Afacerilor Externe ori de câte ori este necesar.
(5) Regulamentul de organizare si functionare a
Consiliului va fi elaborat de către Ministerul Afacerilor Externe în
termen de 60 de zile de la data intrării în vigoare a prezentei
hotărâri, urmând a fi supus spre aprobare Consiliului, în prima reuniune a
acestuia.
(6) Federatia Organizatiilor Neguvernamentale pentru
Dezvoltare este partener al Guvernului României în eforturile de dezvoltare a
politicii nationale de cooperare pentru dezvoltare.
CAPITOLUL VI
Cadrul financiar
Art. 31.
- (1) Finantarea actiunilor specifice aferente asistentei pentru dezvoltare se
asigură de la bugetul de stat, prin bugetul Ministerului Afacerilor
Externe.
(2) Fondurile aferente finantării actiunilor
prevăzute la alin. (1) se asigură din bugetul Ministerului Afacerilor
Externe de la capitolul „Alte servicii publice generale", subcapitolul
„Asistentă natională externă pentru dezvoltare", titlul
„Alte transferuri", articolul „Transferuri curente în
străinătate", alineatul „Cooperare economică
internatională".
(3) Fondurile aprobate potrivit alin. (2) nu se pot
redistribui si utiliza la alte subdiviziuni ale clasificatiei bugetare
CAPITOLUL VII
Dispozitii finale
Art. 32.
- Pe data intrării în vigoare a prezentei hotărâri se
suplimentează numărul de posturi prevăzut pentru Ministerul
Economiei si Finantelor cu un număr de 7 posturi, în vederea îndeplinirii
sarcinilor Oficiului de Plăti si Contractare PHARE în cadrul politicii
nationale de cooperare internatională pentru dezvoltare, conform
Hotărârii Guvernului nr. 386/2007 privind organizarea si functionarea
Ministerului Economiei si Finantelor.
PRIM-MINISTRU
CĂLIN POPESCU-TĂRICEANU
Contrasemnează:
Ministrul afacerilor externe,
Adrian Mihai Cioroianu
Ministrul economiei si finantelor,
Varujan Vosganian
Bucuresti, 11 iulie 2007.
Nr. 747.
ACTE ALE ORGANELOR DE SPECIALITATE ALE ADMINISTRATIEI
PUBLICE CENTRALE
MINISTERUL AGRICULTURII SI DEZVOLTĂRII RURALE
privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi
etal.
În temeiul prevederilor art. 5 din Ordonanta Guvernului
nr. 136/2000 privind măsurile de protectie împotriva introducerii si
răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor
sau produselor vegetale în România, aprobată cu modificări prin Legea
nr. 214/2001,
văzând Referatul de aprobare nr. 292.478 din 1 iunie
2007 al Agentiei Nationale Fitosanitare din cadrul Ministerului Agriculturii si
Dezvoltării Rurale,
în temeiul Hotărârii Guvernului nr. 385/2007 privind
organizarea si functionarea Ministerului Agriculturii si Dezvoltării
Rurale,
ministrul agriculturii si dezvoltării rurale emite prezentul ordin.
Art. 1.
- Prezentul ordin stabileste măsurile care se aplică împotriva
bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., cunoscută
anterior sub denumirea de Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, denumită
în continuare organism, cu privire la plantele-gazdă ale
organismului, prevăzute în anexa nr. I sectiunea I, denumite în continuare material de plantare, în
scopul:
a) localizării si determinării distributiei;
b) prevenirii aparitiei si răspândirii; si
c) împiedicării răspândirii si controlului în
vederea eradicării, dacă a fost semnalată.
Art. 2.
- (1) Organismele oficiale responsabile din România, respectiv unitătile
fitosanitare judetene si a municipiului Bucuresti, efectuează inspectii
oficiale sistematice anuale asupra materialului de plantare originar din raza
lor de activitate.
(2) În scopul identificării altor posibile surse de
contaminare care amenintă productia materialului de plantare, organismele
oficiale responsabile efectuează o evaluare a riscului si, cu exceptia cazului
în care în timpul evaluării nu se identifică niciun risc de
răspândire a organismului, desfăsoară inspectii în zonele de
productie a materialului de plantare pentru detectarea organismului asupra
altor plante decât materialul de plantare prevăzut la art. 1, inclusiv
asupra plantelor-gazdă solanacee sălbatice, precum si asupra apei de
suprafată, asupra deseurilor lichide provenite din procesările
industriale sau din locurile de ambalare, manipulare a materialului de
plantare, utilizate pentru irigarea sau stropirea materialului de plantare. În
functie de riscul identificat se determină extinderea inspectiilor
prevăzute la alin. (1).
(3) Organismele oficiale responsabile pot, de asemenea,
să desfăsoare inspectii oficiale pentru detectarea organismului pe materiale,
cum ar fi mediu de crestere, sol si deseuri solide rezultate din
procesările industriale sau locurile de ambalare.
Art. 3.
- (1) Inspectiile oficiale prevăzute la art. 2 sunt efectuate:
a) asupra materialului de plantare, în conformitate cu
prevederile anexei nr. I sectiunea II pct.
1;
b) asupra plantelor-gazdă, altele decât materialul
de plantare prevăzut la art. 1, si asupra apei, inclusiv asupra deseurilor
lichide, si, dacă este cazul, sunt prelevate probe si supuse testelor de
laborator oficiale sau oficial supravegheate, în conformitate cu metodele
corespunzătoare;
c) după caz, asupra altor materiale, în conformitate
cu metodele corespunzătoare.
(2) Detaliile suplimentare cu privire la procedurile de
inspectie prevăzute la alin. (1), numărul, originea, esalonarea si
perioada prelevării probelor sunt elaborate de Laboratorul Central pentru
Carantină Fitosanitară si aprobate de Agentia Natională
Fitosanitară din cadrul Ministerului Agriculturii si Dezvoltării Rurale,
pe baza principiilor stiintifice, statistice si a biologiei organismului, luând
în considerare sistemul particular de productie a materialului de plantare si,
după caz, al altor plante-gazdă ale organismului.
Art. 4.
- (1) Detaliile si rezultatele inspectiilor oficiale prevăzute la art. 2
trebuie notificate anual celorlalte state membre si Comisiei Europene,
denumită în continuare Comisie, în conformitate cu prevederile
anexei nr. I sectiunea
II pct. 2. Aceste
notificări sunt prezentate până la 1 iunie, cu exceptia celor
referitoare la cartofii de sământă obtinuti din propria exploatatie,
pentru care notificarea este prezentată până la 1 septembrie.
Detaliile si rezultatele recoltelor se referă la productia anului
precedent. Detaliile acestor notificări pot fi prezentate Comitetului Permanent
pentru Sănătatea Plantelor, denumit în continuare Comitet.
(2) În conformitate cu procedura stabilită la art.
19 alin. (2) din Hotărârea Guvernului nr. 563/2007 pentru aprobarea
Normelor metodologice de aplicare a Ordonantei Guvernului nr. 136/2000 privind
măsurile de protectie împotriva introducerii si răspândirii
organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor
vegetale în România, pot fi adoptate:
a) metode adecvate pentru inspectiile si testele de
laborator prevăzute la art. 3 alin. (1) lit. b);
b) metode adecvate pentru inspectiile prevăzute la
art. 3 alin. (1) lit. c);
c) detalii suplimentare ale inspectiilor prevăzute
la art. 3 alin. (2) pentru asigurarea unor niveluri comparabile de asigurare
între statele membre.
Art. 5.
- Organismele oficiale responsabile asigură ca aparitia suspectată
sau prezenta confirmată a organismului pe raza lor de activitate să
fie comunicată Agentiei Nationale Fitosanitare din cadrul Ministerului
Agriculturii si Dezvoltării Rurale.
Art.
6. - În cazul unei aparitii suspectate a
organismului, Laboratorul Central pentru Carantină Fitosanitară sau
alte laboratoare aprobate de Ministerul Agriculturii si Dezvoltării Rurale
efectuează teste de laborator oficiale sau oficial supravegheate, utilizând
pentru materialul de plantare metoda corespunzătoare, conform anexei nr.
II si în conformitate cu conditiile prevăzute în anexa nr. III pct. 1,
sau, în toate celelalte cazuri, orice altă metodă aprobată
oficial, în scopul confirmării sau infirmării aparitiei suspectate a
organismului. În cazul confirmării prezentei organismului, se aplică
prevederile anexei nr. III pct. 2.
Art. 7.
- (1) În asteptarea confirmării sau infirmării aparitiei suspectate a
organismului conform art. 6, în cazurile de aparitie suspectată în care:
a) s-au constatat simptome de diagnostic cauzate de
organism si un rezultat pozitiv prin testul/testele de depistare conform anexei
nr. II sectiunea I
pct. 1 si sectiunea II
a fost identificat; sau
b) a fost identificat un rezultat pozitiv prin testul/testele
de depistare conform anexei nr. II sectiunea I pct. 2 si sectiunea III, Ministerul Agriculturii si
Dezvoltării Rurale prin unitătile fitosanitare:
1. interzice circulatia plantelor si tuberculilor din
toate recoltele, loturile sau transporturile din care au fost prelevate
probele, aceasta putându-se face doar sub control oficial si cu conditia
să se fi stabilit că nu există niciun risc identificabil de
răspândire a organismului;
2. aplică măsurile necesare pentru
identificarea originii aparitiei suspectate;
3. introduce măsuri de precautie suplimentare
adecvate, bazate pe gradul de risc estimat, în special, în legătură
cu productia materialului de plantare si cu circulatia loturilor de cartofi de
sământă, altii decât cei prevăzuti la pct. 1, produsi la locul
de productie de unde s-au prelevat probele prevăzute la pct. 1, în scopul
prevenirii oricărei răspândiri a organismului.
(2) În cazurile aparitiilor suspectate unde există
un risc de contaminare a materialului de plantare sau a apei de suprafată
din sau într-un alt stat membru (state membre), statul membru pe raza
căruia aparitia suspectată a fost înregistrată notifică de
îndată, în conformitate cu riscul identificat, detaliile aparitiei
suspectate altui stat sau altor state membre implicate si corespunzător
cooperării între statele membre mentionate. Statul membru (statele membre)
care a (au) notificat introduce (introduc) măsuri de precautie conform
alin. (1) pct. 3 si iau măsuri suplimentare corespunzătoare, conform
art. 6 si alin. (1) din prezentul articol.
(3) În conformitate cu procedura stabilită în art.
19 alin. (2) din Hotărârea Guvernului nr. 563/2007, sunt adoptate
măsurile prevăzute la alin. (1) pct. 3.
Art. 8.
- (1) Dacă în urma testelor de laborator oficiale sau oficial
supravegheate efectuate pentru materialul de plantare în conformitate cu metoda
prevăzută în anexa nr. II sau, în toate celelalte cazuri, cu orice altă
metodă aprobată oficial se confirmă prezenta organismului într-o
probă prelevată în conformitate cu prezentul ordin, organismele
oficiale responsabile, având în vedere principiile stiintifice fundamentate,
biologia organismului si productia specifică, comercializarea si sistemele
de procesare a plantelor-gazdă ale organismului, dispun măsurile
prevăzute la alin. (2), (3) si (4).
(2) În cazul materialului de plantare organismele
oficiale responsabile:
a) deschid o investigatie pentru determinarea extinderii
si sursei sau surselor primare de contaminare, în conformitate cu prevederile
anexei nr. IV, cu
testări suplimentare în conformitate cu art. 6, cel putin asupra
stocurilor de cartofi de sământă înruditi prin donare; si
b) desemnează ca fiind contaminate materialul de
plantare, transportul si/sau lotul din care s-a prelevat proba si utilajele,
vehiculul, vasul, depozitul sau părti din acestea si orice alte obiecte,
inclusiv materialul de ambalare care a venit în contact cu materialul de
plantare din care a fost prelevată proba;
c) desemnează ca fiind contaminate, dacă este
cazul, câmpul sau câmpurile, unitatea ori unitătile de productie de
culturi protejate si locul sau locurile de productie de unde s-a recoltat
materialul de plantare si din care a fost prelevată proba;
d) pentru probele prelevate în perioada de vegetatie
desemnează ca fiind contaminate câmpul sau câmpurile, locul ori locurile
de productie si, dacă este cazul, unitatea sau unitătile de productie
de culturi protejate din care a fost prelevată proba; si
e) determină, în conformitate cu prevederile anexei
nr. V pct. 1, extinderea
contaminării probabile prin contact înainte sau după recoltare, prin
legături de productie, irigare ori stropire sau printr-o înrudire
clonală cu materialul desemnat contaminat; si
f) demarchează o zonă pe baza desemnării
contaminării în conformitate cu prevederile lit. b), c) si d), a determinării
extinderii contaminării probabile în conformitate cu lit. e) si a
răspândirii posibile a organismului, în conformitate cu prevederile anexei
nr. V pct. 2 (i).
(3) În cazul culturilor de plante-gazdă, altele
decât cele prevăzute la alin. (2), la care productia de material de
plantare este identificată ca risc, organismele oficiale responsabile:
a) deschid o investigatie în conformitate cu prevederile
alin. (2) lit. a); si
b) desemnează ca fiind contaminate
plantele-gazdă ale organismului de la care a fost prelevată proba; si
c) determină contaminarea probabilă si
demarchează o zonă în conformitate cu alin. (2) lit. e) si,
respectiv, lit. f). În legătură cu productia de material de plantare.
(4) în cazul apelor de suprafată, inclusiv al
deseurilor lichide provenite din procesările industriale sau din locurile
de ambalare a materialului de plantare, si pentru plantele-gazdă solanacee
sălbatice asociate, acolo unde productia de material de plantare este
identificată ca risc prin irigatie, stropire sau inundare cu apă de
suprafată, organismele oficiale responsabile:
a) deschid o investigatie, inclusiv o inspectie în
perioade corespunzătoare, pentru probele prelevate din apele de
suprafată si, dacă sunt prezente, pentru plantele-gazdă
solanacee sălbatice, în vederea stabilirii extinderii contaminării;
si
b) desemnează ca fiind contaminată apa de
suprafată din care au fost prelevate proba sau probele,
corespunzătoare extinderii contaminării si în baza investigatiilor
efectuate în conformitate cu lit. a); si
c) determină contaminarea probabilă si
demarchează o zonă pe baza desemnării contaminării în
conformitate cu lit. b) si a posibilei răspândiri a organismului, tinând
seama de prevederile anexei nr. V pct. 1 si pct. 2 (ii).
Art. 9.
- (1) Ministerul Agriculturii si Dezvoltării Rurale, prin Agentia
Natională Fitosanitară, notifică de îndată altor state
membre si Comisiei, în conformitate cu prevederile anexei nr. V
pct. 3, orice contaminare
stabilită conform art. 8 alin. (2) lit. b), c) si d) si alin. (4) lit. b)
si detaliile zonei demarcate conform art. 8 alin. (2) lit. f) si, dacă
este cazul, conform art. 8 alin. (4) lit. c). Detaliile notificării
efectuate conform prevederilor acestui alineat pot fi prezentate Comitetului.
(2) Ministerul Agriculturii si Dezvoltării Rurale,
prin Agentia Natională Fitosanitară, în acelasi timp, va prezenta
Comisiei notificări suplimentare conform anexei nr. V
pct. 4. Detaliile
notificării efectuate conform prevederilor acestui alineat pot fi
prezentate Comitetului.
Art. 10.
- În urma notificării în conformitate cu prevederile art. 9, celelalte
state membre vizate în notificare deschid o investigatie în conformitate cu
art. 8 alin. (2) lit. a) si, dacă este cazul, cu art. 8 alin. (4) lit. a)
si iau măsuri suplimentare, după caz^în conformitate cu art. 8 si 9.
Art. 11.
- Materialul de plantare desemnat ca fiind contaminat conform art. 8 alin. (2)
lit. b), c) si d) nu poate fi plantat si de aceea, sub controlul organismelor
oficiale responsabile, este supus uneia dintre dispozitiile anexei nr. VI
pct. 1, astfel încât
să nu existe niciun risc identificabil de răspândire a organismului.
Art. 12.
- Materialul de plantare desemnat ca fiind probabil contaminat conform art. 8
alin. (2) lit. e) si alin. (4) lit. c), inclusiv materialul de plantare pentru
care a fost identificat un risc, produs în locuri de productie desemnate ca
probabil contaminate în conformitate cu prevederile art. 8 alin. (2) lit. e),
nu poate fi plantai si, sub controlul organismelor oficiale responsabile, este
utilizat sau eliminat în conformitate cu prevederile anexei nr. VI
pct. 2, astfel încât
să nu existe niciun risc identificabil de răspândire a organismului.
Art. 13.
- Orice utilaj, vehicul, vas, depozit sau părti din acestea si orice alte
obiecte, inclusiv materialul de ambalare desemnat ca fiind contaminat conform
art 8 alin. (2) lit b), c) si d) sau desemnat ca fiind probabil contaminat în
conformitate cu prevederile art. 8 alin. (2) lit. e) si alin. (4) lit. c), este
decontaminat sau distrus, utilizându-se metodele prevăzute în anexa nr. VI
pct. 3. După
decontaminare niciun astfel de obiect nu mai este considerat ca fiind
contaminat.
Art 14.
- Fără a prejudicia măsurile implementate conform prevederilor
art. 11-13, organismele oficiale responsabile aplică în zona
demarcată conform art. 8 alin. (2) lit. f) si alin. (4) lit. c) o serie de
măsuri conform prevederilor anexei nr. VI pct. 4.1 si 4.2. Detaliile acestor măsuri se
notifică anual celorlalte state membre si Comisiei. Detaliile acestor
notificări pot fi prezentate Comitetului.
Art. 15. - (1) Cartofii de sământă trebuie
să îndeplinească cerintele Hotărârii Guvernului nr. 563/2007 si
să provină, în linie directă, dintr-un material obtinut în
cadrul unui program aprobat oficial, găsit liber de organism în urma
testelor de laborator oficiale sau oficial supravegheate, utilizându-se metoda
corespunzătoare prevăzută în anexa nr. IL
(2) Testarea prevăzută la alin. (1) este
efectuată:
a) în cazurile în care a fost confirmată prezenta
organismului în productia de cartofi de sământă, se testează:
1. materialul timpuriu de propagare, inclusiv clonele
selectate initial si clonele de bază de cartofi de sământă;
2. toate clonele de bază de cartofi de
sământă sau materialul timpuriu de propagare, inclusiv clonele
selectate initial, în cazurile în care s-a stabilit că nu există
nicio relatie clonală; si
b) în alte cazuri, pe fiecare plantă obtinută
din clonele selectate initial sau esantioanele reprezentative de cartofi de
sământă de bază ori materialul timpuriu de propagare.
(3) în conformitate cu procedura prevăzută la
art. 19 alin. (2) din Hotărârea Guvernului nr. 563/2007, pot fi adoptate
următoarele prevederi:
- regulile detaliate ale aplicării prevederilor
alin. (2) lit. a);
- regulile privind esantioanele reprezentative
prevăzute la alin. (2) lit. b).
Art. 16.
- Detinerea si manipularea organismului sunt interzise.
Art. 17.
- Fără a prejudicia prevederile Hotărârii Guvernului nr.
563/2007, Ministerul Agriculturii si Dezvoltării Rurale, prin Agentia
Natională Fitosanitară, poate aproba derogări de la
măsurile prevăzute la art. 11-14 si 16, pentru testări sau în
scopuri stiintifice si lucrări pentru selectii varietale.
Art. 18.
- (1) Ministerul Agriculturii si Dezvoltării Rurale, prin Agentia
Natională Fitosanitară, poate adopta măsuri suplimentare sau mai
stricte pentru combaterea organismului sau pentru prevenirea răspândirii
lui, în conformitate cu prevederile Hotărârii Guvernului nr. 563/2007.
(2) Ministerul Agriculturii si Dezvoltării Rurale,
prin Agentia Natională Fitosanitară, notifică detaliile
măsurilor prevăzute la alin. (1) celorlalte state membre si Comisiei.
Detaliile acestor notificări pot fi prezentate Comitetului.
Art 19.
- Anexele nr. I-VII fac parte integrantă din prezentul ordin.
Art. 20.
- Prezentul ordin transpune prevederile Directivei Consiliului 98/57/CEE privind
controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., publicată
în Jurnalul Oficial al Uniunii Europene (JOUE) nr. 10057 din 30 iulie 2006,
modificată si completată prin Directiva Consiliului 2006/63,
publicată în Jurnalul Oficial al Uniunii Europene (JOUE) nr. L 206 din 27
iulie 2006.
Art. 21.
- Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si pădurilor nr. 632/2002
privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et
al., publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I,
nr. 327 si 327 bis din 14
mai 2003, se abrogă.
Art. 22.
- Prezentul ordin se publică în Monitorul Oficial al României, Partea I.
Ministrul agriculturii si dezvoltării rurale,
Decebal Traian Remes
Bucuresti, 13 iulie 2007.
Nr. 586.
ANEXA Nr. I
SECTIUNEA I
Lista plantelor-gazdă ale bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. prevăzute
la art 1
Plante (inclusiv tuberculi), altele decât semintele
propriu-zise de Solanum tuberosum L (cartof)
Plante, altele decât fructele si semintele de Lycopersicon
lycopersicum (L.) Karsten ex. Farw (tomate)
SECTIUNEA II
1. Inspectiile prevăzute la art. 3 din ordin se
bazează pe biologia organismului si pe sistemele de productie proprii: (i)
în cazul cartofului:
- în perioade corespunzătoare, inspectia
vizuală a culturii si/sau prelevarea de probe atât de cartofi de
sământă, cât si de alte tipuri de cartofi în perioada de vegetatie
sau în perioada de depozitare. Aceste probe sunt supuse unei inspectii vizuale
prin sectionarea tuberculilor; si -în cazul cartofilor de sământă si,
dacă este cazul, pentru alte tipuri de cartofi se efectuează teste de
laborator oficiale sau oficial supravegheate, utilizându-se metoda
stabilită în anexa nr. II; (ii) în cazul tomatelor:
- inspectie vizuală, în perioade corespunzătoare,
cel putin în perioada de vegetatie a plantelor destinate replantării în
scop profesional. 2. Notificarea inspectiilor prevăzute la art. 4 alin.
(1) din ordin include:
(i) În cazul inspectiilor asupra cartofilor:
-suprafata totală estimată cultivată, în
hectare, cu cartofi de sământă si alte tipuri de cartofi;
- stratificarea după categorie a cartofilor de
sământă si de consum si, după caz, pe regiune;
- numărul si perioada de prelevare a probelor pentru
testare;
- numărul inspectiilor vizuale din câmp;
- numărul de inspectii vizuale asupra tuberculilor
si dimensiunea probei;
(ii) În cazul inspectiilor la plantele de tomate
destinate replantării în scop profesional, în perioada de vegetatie:
- numărul total estimat de plante;
- numărul inspectiilor vizuale;
(iii) În cazul inspectiilor asupra planteior-gazdă,
altele decât cartofi si tomate, inclusiv plante-gazdă solanacee
sălbatice:
- speciile;
- numărul si perioada prelevării probelor;
- zona/râul de unde au fost prelevate probele, acolo unde
este cazul;
- metoda de analiză;
(iv) În cazul inspectiilor asupra apei si deseurilor
lichide deversate din procesarea industrială sau din locurile de ambalare:
- numărul si perioada prelevării probelor;
- zona/râul/ locul de prelevare a probelor, acolo unde
este cazul;
- metoda de analiză.
ANEXA Nr. II
PROTOCOLUL DE TESTARE
pentru diagnoza, detectia si identificarea bacteriei Ralstonia
solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.
SCOPUL PROTOCOLULUI DE TESTARE
Protocolul prezentat descrie diversele proceduri implicate
în: (i) diagnoza putregaiului brun al tuberculilor de cartof si a vestejirii
bacteriene la plantele de cartof, tomate, precum si la alte câteva
plante-gazdă; (ii) detectia bacteriei Ralstonia solanacearum în
probele de tuberculi de cartof, plante de cartof, tomate si în alte
plante-gazdă, în apă sau în sol; (iii) identificarea bacteriei Ralstonia
solanacearum.
PRINCIPII GENERALE
Protocoalele optimizate pentru diversele metode,
validarea reactivilor si detaliile pregătirii materialului necesar pentru
teste si controale figurează în apendiei. O listă a laboratoarelor
care realizează optimizarea si validarea protocoalelor este
prevăzută în apendicele 1.
Dat fiind faptul că protocoalele implică
detectia unui organism dăunător care trebuie pus sub carantină
si includ utilizarea de culturi viabile de Ralstonia solanacearum, în
calitate de material de control, este necesară aplicarea de proceduri de
carantină corespunzătoare care prevăd instalatii adecvate de
eliminare a deseurilor si în conditiile existentei unor licente
corespunzătoare eliberate de către autoritătile oficiale de
carantină.
Parametrii testelor trebuie să garanteze o detectie
coerentă si reproductibilă a nivelurilor de Ralstonia solanacearum
la pragurile stabilite prin metodele selectionate.
Pregătirea exactă a controalelor pozitive este
imperativă.
Efectuarea testelor în conformitate cu pragurile impuse
implică, de asemenea, stabilirea parametrilor corecti, întretinerea si
calibrarea echipamentelor, manipularea si păstrarea corectă a reactivilor
si toate măsurile menite să împiedice contaminarea între probe, de
exemplu, separarea controalelor pozitive si a probelor testate. Trebuie
aplicate standarde de control de calitate pentru a se evita erori
administrative si de alt gen, în special în ceea ce priveste etichetarea si
documentarea.
O aparitie suspectă, în sensul art. 7 alin. (1) din
ordin, implică un rezultat pozitiv al testelor de diagnostic sau de
detectie realizate asupra unei probe în conformitate cu diagramele functionale
prezentate în continuare. Un prim test de detectie pozitiv: testul de
imunofluorescentă (IF), testul reactiei de polimerizare în lant (PCR),
testul de hibridizare fluorescentă in situ (FISH), izolare
selectivă trebuie confirmat de un al doilea test de detectie bazat pe un
alt principiu biologic.
În cazul în care primul test de detectie este pozitiv, se
suspectează o contaminare cu Ralstonia solanacearum si trebuie
efectuat un al doilea test de detectie. În cazul în care al doilea test de
detectie este pozitiv, presupunerea se confirmă (aparitie suspectată)
si trebuie continuate testele în conformitate cu procedura. În cazul în care al
doilea test de detectie este negativ, proba este considerată ca fiind
necontaminată cu Ralstonia solanacearum.
Prezenta confirmată mentionată la art. 8 alin.
(1) din ordin implică izolarea si identificarea unei culturi pure de Ralstonia
solanacearum cu confirmarea patogenitătii.
SECTIUNEA I
Aplicarea protocolului de testare
1. Procedura
de detectie pentru diagnoza vestejirii bacteriene {Ralstonia solanacearum) la
tuberculi de cartof, plante de cartof, plante de tomate sau alte
plante-gazdă care prezintă simptome de vestejire bacteriană
Protocolul de testare este destinat tuberculilor de
cartof si plantelor cu simptome tipice sau suspecte de vestejire
bacteriană. Presupune un test de detectie rapidă, izolarea agentului
patogen din tesutul vascular infectat pe un mediu (selectiv) si, în cazul unui
rezultat pozitiv, identificarea culturii ca fiind Ralstonia solanacearum.
(1) Descrierea simptomelor este prevăzută la
sectiunea 11.1.
(2)
Testele de selectie rapidă usurează diagnosticul prezumtiv, dar nu
sunt esentiale. Un rezultat negativ nu garantează întotdeauna absenta
agentului patogen.
(3)
Testul de eliminare a exsudatului din tesutul vascular al tulpinii este descris
în sectiunea VI.A.1.
{4)
Testul de detectie a granulelor de poli-p-hidroxibutirat în celulele bacteriene
este descris în sectiunea VI.A.2.
(5)
Testele de seroaglutinare asupra exsudatului bacterian sau asupra extractelor
din tesuturile simptomatice sunt descrise în sectiunea VI.A.3.
(6)
Testul IF asupra exsudatului bacterian, suspensiei de apă sau asupra
extractelor din tesuturi simptomatice este descris în sectiunea VI.A.5.
(7) Testul FISH asupra exsudatului bacterian, suspensiei de
apă sau asupra extractelor din tesuturi simptomatice este descris în
sectiunea VI.A.7.
80
Testul ELISA asupra exsudatului bacterian, suspensiei de apă sau asupra
extractelor din tesuturi simptomatice este descris în sectiunea VI.A.8.
(9) Testul
PCR asupra exsudatului bacterian, suspensiei de apă sau asupra extractelor
din tesuturi simptomatice este descris în sectiunea VI.A.6.
(10)
În general, agentul patogen se izolează usor din materialul vegetal
simptomatic prin însâmântare pe mediu nutritiv (sectiunea II.3).
(11)
Morfologia coloniei tipice este descrisă în sectiunea II.3.d).
(12)
Cultivarea riscă să esueze în stadiile avansate de infectare din
cauza concurentei sau a înmultirii bacteriilor saprofite. in cazul în care
simptomele bolii sunt caracteristice, dar testul de izolare este negativ,
izolarea trebuie repetată, de preferintă printr-un test de
însâmântare pe medii selective.
(13)
Identificarea fiabilă a culturilor pure de izolate prezumtive de Ralstonia
solanacearvm necesită efectuarea testelor descrise în sectiunea VI.
B. O caracterizare
subspecifică este facultativă, dar recomandată pentru fiecare
caz nou.
(14)
Testul de patogenitate este descris în sectiunea VI. C.
2. Procedura
pentru detectia si identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în
probe de tuberculi de cartof asimptomatici
Principiu
Protocolul de testare este destinat detectiei infectiilor
latente ale tuberculilor de cartof. Un rezultat pozitiv a cel putin două
teste de detectie bazate pe principii biologice diferite trebuie completat prin
izolarea agentului patogen, urmată, în cazul izolării coloniilor
caracteristice, de confirmarea unei culturi pure ca fiind Ralstonia solanaceamm.
Un rezultat pozitiv la un singur test de detectie nu este suficient pentru
a considera proba ca fiind suspectă.
Testele de detectie si testele de izolare trebuie să
permită detectia a 10M04 celule pe ml de extract concentrat în
suspensie, incluse în fiecare serie de teste în calitate de controale pozitive.
(1)
Mărimea standard a probei este de 200 de tuberculi. Cu toate acestea,
protocolul poate fi aplicat probelor mai mici în cazul în care nu sunt
disponibili 200 de tuberculi.
(2)
Extragerea agentului patogen si metodele de concentrare sunt descrise în
sectiunea III. 1.1.
(3)
în cazul în care cel putin două teste bazate pe principii biologice
diferite sunt pozitive, trebuie efectuate izolarea si confirmarea. A se efectua
cel putin un test rapid de detectie, tn cazul în care acest test este negativ,
proba este considerată ca fiind negativă, fn cazul în care acest test
este pozitiv, este nevoie de un al doilea sau mai multe teste de detectie
rapidă bazate pe principii biologice diferite pentru a verifica primul
rezultat pozitiv. Tn cazul în care al doilea test sau celelalte teste sunt
negative, proba este considerată ca fiind negativă. Nu sunt necesare
alte teste.
(4)
Testul IF este descris în sectiunea VI.A.5.
(5)
Testul de izolare selectivă este descris în sectiunea VI.A.4.
(6)
Testele PCR sunt descrise în sectiunea VI.A.6.
(7)
Testul FISH este descris în sectiunea VI.A.7.
(8)Testele
ELISA sunt descrise în sectiunea VI.A.8.
(9)
Testul biologic este descris în sectiunea VI.A.9.
(10)
Morfologia tipică a coloniei este descrisă în sectiunea II.3.d).
(11)
Cultivarea sau testele biologice riscă să esueze din cauza
concurentei sau a inhibitiei de către bacteriile saprofite. În cazul în
care se obtin rezultate pozitive dare în urma testelor rapide de detectie,
însă testele de izolare sunt negative, trebuie repetate testele de izolare
din acelasi extract concentrat sau din tesutul vascular suplimentar prelevat de
la talonul tuberculilor tăiati din aceeasi proba si, după caz,
trebuie testate probele suplimentare.
(12)
Identificarea fiabilă a culturilor pure de izolate prezumtive de Ralstonia
solanacearum necesită efectuarea testelor descrise în sectiunea VI.B.
(13)
Testul de patogenitate este descris în sectiunea VI.C.
3. Procedură pentru detectia st identificarea
bacteriei Ralstonia solanacearum în probele de plante-gazdă de
cartofi si tomate sau alte plante-gazdă asimptomatice
(1)
Pentru mărimea recomandată a probelor a se vedea sectiunea III.2.1.
(2)
Extragerea agentului patogen si metodele de concentrare sunt descrise în
sectiunea 111.2.1.
(3)în
cazul tn care cel putin două teste bazate pe principii biologice diferite
sunt pozitive, trebuie efectuate izolarea si confirmarea. A se efectua cel
putin un test rapid de detectie, fn cazul în care acest test este negativ,
proba este considerată ca fiind negativă. In cazul în care acest test
este pozitiv, este nevoie de un al doilea sau mai multe teste de detectie
rapidă, bazate pe principii biologice diferite, pentru a verifica primul
rezultat pozitiv. În cazul în care al doilea test sau celelalte teste sunt
negative, proba este considerată ca fiind negativă. Nu sunt necesare
alte teste.
(4)
Testul de izolare selectivă este descris în sectiunea VI.A.4.
(5)Testul
IF este descris în sectiunea VI.A.5.
(6)Testele
PCR sunt descrise în sectiunea VI.A.6.
(7)Testul
FISH este descris în sectiunea VI.A.7.
(8)Testele
ELISAsunt descrise în sectiunea VI.A.8.
(9)Testul
biologic este descris în sectiunea VI.A.9.
(10)
Morfologia tipică a coloniei este descrisă în sectiunea ll.3.d).
(11)
Cultivarea sau testele biologice riscă să esueze din cauza
concurentei sau a inhibitiei de către bacteriile saprofite. fn cazul în
care se obtin rezultate pozitive clare î
în urma testelor rapide de detectie, însă testele de izolare sunt
negative, trebuie repetate testele de izolare.
(12)
Identificarea fiabilă a culturilor pure de izolări prezumtive de Ralstonia
solanacearum se obtine prin efectuarea testelor descrise în sectiunea VI.B.
(13) Testul de patogenitate este descris în sectiunea VI.C.
Metode detaliate pentru detectia bacteriei Ralstonia solanacearum la tuberculii de cartof, la
plantele-gazdă de cartof
si de tomate sau la alte plante-gazdă cu simptome de
vestejire bacteriană
1. Simptome (vezi website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main )
1.1. Simptome la cartof
Pe plante. Stadiul incipient al infectiei în câmp este reprezentat de vestejirea
frunzelor înspre vârful plantei în timpul temperaturilor diurne ridicate si de
revenirea la aspect normal în timpul noptii. În cursul primelor stadii de vestejire,
frunzele rămân verzi, dar mai târziu apare o îngălbenire si o
necroză brună. De asemenea, apare epinastia. Vestejirea unui
lăstar sau a unor plante întregi devine repede ireversibilă si duce
la moartea plantei. Tesutul vascular în sectiune transversală prin tulpina
plantelor vestejite poate deveni brun si un exsudat lăptos apare la
suprafata tăieturii sau poate fi extras usor prin presare. Dacă
tulpina sectionată se asază în pozitie verticală în apă,
din tesutul vascular se elimină un exsudat vâscos asemănător
unui firicel.
Pe tuberculi. Se sectionează tuberculii de cartof transversal aproape de hil
(punctul de insertie cu stolonul) sau longitudinal până la stolon. În
stadiul incipient al infectiei apare o decolorare galben-sticloasă spre
brun-deschis a inelului vascular din care se elimină un exsudat crem-pal
în mod spontan după câteva minute. Ulterior, decolorarea vasculară
devine de un brun mai distinct, iar necroza se poate extinde la tesutul
parenchimatos. În stadii avansate, infectia se propagă la nivelul
stolonilor si al ochilor din care se elimină bacterii ce permit aderarea
particulelor de sol. Coaja tuberculilor poate prezenta leziuni de culoare
brun-roscat usor adâncite, provocate de colapsul intern al tesutului vascular.
In stadiile avansate ale bolii se dezvoltă putregaiuri fungice si
bacteriene.
1.2. Simptome la tomate
Pe plante. Primul simptom vizibil este vestejirea aparentă a frunzelor tinere. În
conditii favorabile agentului patogen (temperatura solului circa 25°C,
umiditate saturată), în câteva zile apar epinastia si vestejirea unei
părti din plantă sau a întregii plante, ce duc la colapsul total al
plantei. În conditii mai putin favorabile (temperatura solului sub 21 °C),
vestejirea este mai putin pronuntată, dar se poate dezvolta un număr
mare de rădăcini adventive pe tulpină. Este posibilă
observarea unei benzi subtiri unsuroase de-a lungul tulpinii, plecând de la
baza acesteia, ce dovedeste necroza sistemului vascular. În cazul în care
tulpina este sectionată transversal, din tesuturile vasculare
brun-decolorat ale tulpinii se elimină un exsudat bacterian alb sau
gălbui.
1.3. Simptome la alte plante-gazdă
Solanum dulcamara si Solanum nigrum. În conditii naturale rareori se
observă simptome de vestejire la aceste plante-gazdă, cu exceptia
cazurilor în care temperatura solului este mai mare de 25°C sau nivelurile de
inoculum sunt extrem de ridicate (de exemplu, pentru Solanum nigrum care
se dezvoltă în vecinătatea plantelor de cartof sau de tomate
bolnave). În cazul în care intervine ofilirea, simptomele sunt identice cu cele
descrise pentru tomată. Plantele de Solanum dulcamara care nu se
vestejesc si se dezvoltă cu tulpina si rădăcina în apă pot
prezenta o usoară decolorare brună a tesutului vascular pe partea
transversală a tulpinii sau pe părtile tulpinii aflate sub apă.
În cazul în care se pune o tulpină tăiată în pozitie
verticală în apă, se pot observa fire de exsudat bacterian chiar în
absenta simptomelor de vestejire.
2. Teste rapide de detectie
Testele rapide de detectie facilitează diagnosticul
prezumtiv, dar nu sunt esentiale. Se folosesc unul sau mai multe dintre
următoarele teste validate:
2.1. Testul eliminării exsudatului bacterian din
tulpină (vezi sectiunea VI. A. 1)
2.2. Detectia granulelor de poli-B-hidroxibutirat (PHB)
Granulele tipice de PHB din celulele de Ralstonia
solanacearum pot fi vizualizate prin colorarea cu albastru de Nil A sau cu negru de
Sudan B (vezi sectiunea VI.A.2) a frotiurilor de exsudat bacterian din tesutul
infectat, fixate prin flacără pe o lamă de microscop.
2.3. Testul serologic de aglutinare (vezi sectiunea
VI.A.3)
2.4. Alte teste
Alte teste rapide de detectie sunt testul IF (vezi
sectiunea VI.A.5), testul FISH (vezi sectiunea VI.A.7), testele ELISÂ(vezi
sectiunea VI.A.8) si testele PCR (vezi sectiunea VI. A.6).
3. Procedura de izolare
a) Se îndepărtează exsudatul sau sectiunile de
tesut decolorat de la nivelul inelului vascular al tuberculului de cartof sau
din căile vasculare ale tulpinii plantei de cartof, plantei de tomată
sau de alte plante-gazdă vestejite. Se pune în suspensie, într-un volum
mic de apă distilată sterilă sau într-un tampon fosfat de 50 mM
(apendicele 4). Se lasă 5-10 minute pe masă.
b) Se prepară o serie de dilutii zecimale ale
suspensiei.
c) Se transferă 50-100 ui de suspensie si de dilutii
pe un mediu nutritiv general (NA, YPGA sau SPA; vezi apendicele 2) si/sau pe
mediul de tetrazolkj Kelman (apendicele 2) si/sau pe un mediu selectiv validat
(de exemplu, SMSA; vezi apendicele 2). Se însământează printr-o
tehnică corespunzătoare. În cazul în care se consideră util, separat,
se însământează plăci Petrii cu o suspensie diluată de
celule de Ralstonia solanacearum biovar 2 drept control pozitiv.
d) Se incubează plăcile timp de 2-6 zile la
28°C.
- Pe mediu nutritiv general, izolatele virulente de Ralstonia
solanacearum formează colonii fluide, cu margini neregulate, plate,
albicioase, deseori cu verticile caracteristice în centru. Formele avirulente
de Ralstonia solanacearum formează mici colonii rotunjite,
nefluide, untoase, de culoare albicioasă uniformă.
- Pe mediu tetrazoliu Kelman si pe mediu SMSA,
verticilele sunt de culoare rosu-sângeriu. Formele avirulente de Ralstonia
solanacearum formează colonii mici, rotunjite, untoase, nefluide de
culoare rosu-închis.
4. Teste
de identificare a bacteriei Ralstonia solanacearum
Testele care permit identificarea izolatelor prezumtive
de Ralstonia solanacearum sunt prevăzute în sectiunea VLB.
SECTIUNEA a III-a
1. Metode detaliate pentru detectia si identificarea
bacteriei Ralstonia solanacearum în probe de tuberculi de cartof asimptomatici
1.1. Pregătirea probei
NOTE:
- Mărimea standard a unei probe este de 200 de
tuberculi. O procedură mai intensivă de prelevare implică
efectuarea de teste pe mai multe probe de această mărime. O
probă cu un număr mai mare de tuberculi determină o inhibitie
sau o interpretare dificilă a rezultatelor. Cu toate acestea, procedura se
poate aplica în mod convenabil probelor cu mai putin de 200 de tuberculi.
- Validarea tuturor metodelor de detectie descrise în
continuare se bazează pe efectuarea unor teste pe probe de 200 de
tuberculi.
- Extractul de cartof descris în continuare poate fi, de
asemenea, utilizat pentru detectia prezentei bacteriei responsabile de
putregaiul inelar al cartofului, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.
Optiuni de pretratare care pot fi efectuate înaintea
preparării probei:
a) Se incubează proba la 25-30°C până la
două săptămâni pentru a favoriza înainte de efectuarea testelor
multiplicarea eventualelor populatii bacteriene de Ralstonia solanacearum.
b) Se spală tuberculii. Se utilizează
dezinfectanti (compusi clorurati în cazul în care testul PCR este folosit
pentru a îndepărta ADN patogen) si detergenti corespunzători între
fiecare probă. Tuberculii se usucă la aer. Această procedură
de spălare este deosebit de utilă (dar nu obligatorie) pentru probele
cu particule de sol în exces si în cazul în care se realizează un test PCR
sau o procedură de izolare directă.
1.1.1. Cu un bisturiu sau un cutit pentru legume curat si
dezinfectat se îndepărtează coaja de la nivelul hilului (punctul de
insertie cu stolonul) fiecărui tubercul, astfel încât să fie vizibil
tesutul vascular. Se taie cu atentie un miez mic de tesut vascular (con de
tesut vascular) de la nivelul hilului. Cantitatea de tesut extravascular
trebuie redusă la minimum (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main
).
notă: - Se separă
tuberculii (în putrefactie) cu simptome de putregai brun si se testează
separat.
în cazul în care, la îndepărtarea conului de tesut
vascular de la nivelul hilului, se observă simptome de putregai brun,
trebuie să se realizeze o examinare vizuală a tuberculului respectiv
si o sectionare a acestuia lângă nil. Orice tubercul tăiat care
prezintă simptome suspecte trebuie păstrat timp de cel putin
două zile la temperatura ambiantă pentru a permite formarea unui
strat de suber, iar apoi depozitat la o temperatură de refrigerare (între
4 si 10°C) în conditii de carantină corespunzătoare. Toti tuberculii,
inclusiv cei cu simptome suspecte, trebuie păstrati în conformitate cu
anexa nr. III.
1.1.2. Se colectează conurile în recipiente de
unică folosintă neutilizate care pot fi închise si/sau sigilate (în
cazul în care recipientele sunt refolosite, ele trebuie spălate si
dezinfectate cu compusi ctorinatj). Este preferabil ca conurile să fie
prelucrate imediat. În cazul în care nu este posibil, acestea se
depozitează în recipiente, fără adăugarea unui tampon,
pentru cel mult 72 de ore în frigider si cel mult 24 de ore la temperatura
ambiantă.
Se prelucrează conurile prin una dintre
următoarele proceduri:
a) se acoperă conurile cu un volum suficient (circa
40 ml) de tampon de extractie (apendicele 4) si se agită pe un agitator
rotativ (50-100 turatii/minut) timp de 4 ore la o temperatură mai
mică de 24°C sau la o temperatură de refrigerare timp de 16-24 de
ore; sau
b) conurile se omogenizează cu un volum suficient
(circa 40 ml) de tampon de extractie (apendicele 4) într-un mixer (de exemplu,
Waring sau Ultra Thurax) sau se măruntesc într-un sac de macerare de
unică folosintă sigilat (de exemplu, sac Stomacher sau de tip
„Bioreba strong gauge polythene" de 150 mm x 250 mm sterilizat prin
radiatii) cu ajutorul unui ciocan de cauciuc sau al unui dispozitiv de măcinare
corespunzător (de exemplu, Homex).
notă.- Riscul de contaminare încrucisată a probelor este
considerabil în cazul în care probele sunt omogenizate într-un mixer. Ase lua
măsuri de precautie pentru a se evita producerea de aerosoli sau scurgeri
în timpul procesului de extractie. A se utiliza palete de mixer si recipiente
sterilizate pentru fiecare probă. La efectuarea testului PCR, se
evită transferul de ADN pe recipientele sau dispozitivele de
măcinare. În cazul în care se recurge la testul PCR, se recomandă
măcinarea în saci de unică folosintă si utilizarea de tuburi de
unică folosintă.
1.1.3. Se decantează supernatantul. În cazul în care
acesta este prea tulbure, se filtrează printr-o centrifugare la
viteză mică (la 180 g maximum timp de 10 minute, la o
temperatură de 4-10°C) sau printr-o filtrare în vid (40-100 um),
spălându-se filtrul cu un tampon de macerare suplimentar (10 ml).
1.1.4. Bacteriile se concentrează prin centrifugare
la 7.000 g timp de 15 minute (sau la 10.000 g timp de 10 minute) la o
temperatură de 4-10°C si se îndepărtează supernatantul
fără a deranja sedimentul (extract concentrat).
1.1.5. Sedimentul se resuspendă în 1,5 ml tampon
concentrat (apendicele 4). Se folosesc 500 μl pentru a testa Ralstonia
solanacearum, 500 μl pentru Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus
si 500 μl pentru referintă. Se adaugă giicerol steril la
concentratia finală de 10-25 % (volum) la 500 μl de alicote de
referintă si la alicota de testare rămasă, se omogenizează
în vortex si se depozitează la o temperatură situată între -16
si - 24°C (săptămâni) sau între - 68 si - 86°C (luni). Alicotele de
testare se păstrează în timpul testelor la o temperatură de
4-10°C.
Nu se recomandă congelările si
decongelările repetate, în cazul în care extractele trebuie transportate,
livrarea trebuie efectuată într-o geantă frigorifică în termen
de 24 de ore.
1.1.6. Este absolut necesar ca toate controalele pozitive
de Ralstonia solanacearum si probele să fie tratate separat pentru
a evita orice contaminare. Această conditie se aplică atât pentru
lamele de imunofluorescentă, cât si pentru toate testele.
1.2. Testele
Ase vedea diagrama si descrierea testelor si a
protocoalelor optimizate în apendicele corespunzătoare:
Izolare selectivă (vezi sectiunea VI.A.4)
Testul IF (vezi
sectiunea VI.A.5)
Testele PCR (vezi sectiunea VI.A.6)
Testul FISH (vezi sectiunea VI.A.7)
Testele ELISA (vezi sectiunea VI.A.8)
Testul biologic (vezi sectiunea VI.A.9)
2. Metode
detaliate pentru detectia si identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în
probe de plante de cartof si plante de tomate sau alte plante-gazdă
asimptomatice
2.1. Pregătirea probei
notă: Pentru detectia populatiilor latente de Ralstonia
solanacearum, se recomandă testarea unor serii de probe. Procedura
poate fi aplicată cu usurintă probelor care contin până la 200
de bucăti de tulpini. În cazul în care se efectuează supravegheri,
acestea trebuie bazate pe o probă reprezentativă din punct de vedere
statistic pentru populatia vegetală în cauză.
2.1.1. Se colectează bucăti de tulpină de 1-2
cm într-un recipient steril închis, în conformitate cu următoarele
proceduri de prelevare:
Plantule de tomată (răsaduri): cu ajutorul unui cutit curat si dezinfectat se taie o
bucată de 1 cm la baza fiecărei tulpini, chiar deasupra nivelului
solului.
Plante de tomate cultivate în seră sau în câmp: cu ajutorul unui cutit curat si dezinfectat se
îndepărtează lăstarul cel mai de jos al fiecărei plante,
tăind chiar deasupra jonctiunii cu tulpina principală. Se
îndepărtează o bucată de 1 cm de la baza fiecărui
lăstar lateral.
Alte plante-gazdă: cu ajutorul unui cutit sau al unei foarfeci de
grădină curate si dezinfectate se taie o bucată de 1 cm de la
baza fiecărei tulpini, chiar deasupra nivelului solului. În cazul
buruienii Solanum dulcamara sau al altor plante-gazdă care cresc în
apă, se taie bucăti de 1-2 cm din tulpinile care se găsesc sub
apă sau din stolonii cu rădăcini acvatice.
în caz de prelevare într-o anumită zonă, se
recomandă să se testeze o probă reprezentativă din punct de
vedere statistic de cel putin 10 plante pe punct de prelevare pentru fiecare
potentială buruiană-gazdă. Detectia agentului patogen se face
în modul cel mai fiabil la sfârsitul primăverii,
vara si toamna, desi infectiile naturale pot fi detectate pe tot parcursul
anului la plantele perene de Solanum dulcamara care cresc în apă.
Gazdele cunoscute sunt plantele spontane de cartof, Solanum dulcamara,
Solanum nigmm, Datura stramonium si alte specii din familia Solanaceae.
Pelargonium spp. si Portulaca oleracea sunt, de asemenea, plante-gazdă.
Printre anumite buruieni europene care pot găzdui la nivelul
rădăcinii si/sau rizosferei tulpini virulente de Ralstonia
solanacearum biovar 2, rasa 3, în conditii de mediu specifice, se
numără Atriplex hastata, Bidens μllosâ, Cerastium glomeratum,
Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus
scleratus, Rorippa spp., Silene alba, S. nutans, Tussilago farfanra si
Urtica dioica.
notă: în această etapă se poate efectua examinarea
vizuală a simptomelor interne (coloratie vasculară sau exsudat
bacterian). Se separă orice bucată de tulpină cu simptome si se
testează în mod separat (vezi sectiunea II).
2.1.2. Se efectuează o dezinfectare scurtă a
bucătilor de tulpină cu etanol de 70% si se usucă de îndată
cu ajutorul hârtiei absorbante. Apoi se prelucrează bucătile de
tulpină în conformitate cu una dintre următoarele proceduri:
a) se acoperă cu un volum suficient (circa 40 ml) de
tampon de extractie (apendicele 4) si se agită pe un agitator rotativ
(50-100 turatii/minut) timp de 4 ore la o temperatură mai mică de
24°C sau la o temperatură de refrigerare timp de 16-24 de ore; sau
b) bucătile de tulpină se zdrobesc de
îndată într-un sac de macerare rezistent (de exemplu, Stomacher sau
Bioreba) cu un
volum corespunzător de tampon de extractie
(apendicele 4), cu ajutorul unui ciocan de cauciuc sau al unui dispozitiv de
măcinare corespunzător (de exemplu, Homex). În cazul în care acest
lucru nu este posibil, bucătile se păstrează, fără a
depăsi 72 de ore, la temperatură de refrigerare sau 24 de ore la
temperatura ambiantă.
2.1.3. Se decantează supernatantul după o
sedimentare de 15 minute.
2.1.4. De obicei, nu este necesară o limpezire
suplimentară a extractului sau a concentratului decantat, dar poate fi
realizată prin filtrare si/sau centrifugare în conformitate cu metoda
prevăzută la pct. 1.1.3-1.1.5.
2.1.5. Se împarte extractul initial sau concentrat în
două părti egale. Se păstrează jumătate la o
temperatură de 4-10°C pe parcursul testului si se conservă
cealaltă jumătate cu 10-25 % (volum) glicerol steril la o
temperatură situată între -16 si - 24°C (săptămâni) sau
între - 68 si - 86°C (luni), în cazul în care este necesar un test suplimentar.
2.2. Teste
A se vedea diagrama si descrierea testelor si
protocoalelor optimizate în apendicele corespunzătoare: Izolarea
selectivă (vezi sectiunea VI. A.4) Testul IF (vezi sectiunea VI.
A.5) Testele PCR (vezi
sectiunea VI. A.6)
Testul FISH (vezi sectiunea VI. A.7) Testele ELISA (vezi sectiunea VI.
A.8) Testul biologic (vezi
sectiunea VI. A.9)
SECTIUNEA a
IV-a
1. Procedură pentru detectia si identificarea
bacteriei Ralstonia solanacearum în apă
2. Metode
pentru detectia si identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în
apă
Principiu
Procedura de detectie validată descrisă în
prezenta sectiune se aplică pentru detectia agentului patogen în probe de
apă de suprafată si poate fi folosită, de asemenea, pentru a
testa probele de deseuri lichide provenite din prelucrarea cartofilor sau
probele provenite din ape reziduale. Cu toate acestea, trebuie retinut faptul
că sensibilitatea de detectie variază în functie de substrat.
Sensibilitatea testului de izolare este afectată de populatiile de
bacterii saprofite concurente care sunt, în general, mult mai numeroase în
probele provenite din prelucrarea cartofilor si din ape reziduale decât în
apele de suprafată. În timp ce procedura descrisă în continuare
trebuie să detecteze numai 103 celule/l în apele de
suprafată, sensibilitatea de detectie în deseurile provenite din
prelucrarea cartofilor sau ape reziduale poate fi mult mai slabă. Din
acest motiv, se recomandă testarea deseurilor după eventualele
tratamente de purificare (de exemplu, sedimentare sau filtrare) pe parcursul
cărora se reduc populatiile de bacterii saprofite. Limitele
sensibilitătii procedurii de testare trebuie avute în vedere atunci când
se evaluează fiabilitatea rezultatelor negative obtinute, după caz.
Desi această procedură a fost efectuată cu succes în studiile
destinate să stabilească prezenta sau absenta agentului patogen în
apele de suprafată, limitele sale trebuie luate în considerare atunci când
este utilizată în lucrări asemănătoare privind deseurile
provenite din prelucrarea cartofilor sau apelor reziduale.
2.1. Pregătirea probei
NOTE:
- Detectia bacteriei Ralstonia solanacearum în
apele de suprafată se face în mod mai fiabil la sfârsitul primăverii,
vara si toamna, atunci când temperatura apei este mai mare de 15°C.
- Reînceperea prelevării în momente diferite pe
parcursul perioadei mentionate anterior în punctele de prelevare desemnate va
spori fiabilitatea detectiei, reducând consecintele variatiilor climatice.
- Trebuie să se tină seama de consecintele
ploilor abundente si de geografia cursului apei pentru a evita efectele de
diluare considerabile care pot ascunde prezenta agentului patogen.
- Se prelevă probe de apă de suprafată în
apropierea plantelor-gazdă în cazul în care aceste plante-gazdă sunt
prezente.
2.1.1. În punctele de prelevare selectionate, probele de
apă se colectează prin umplerea unor tuburi sau sticle sterile de
unică folosintă la o adâncime, atunci când este posibil, mai mare de
30 cm si la o distantă maximă de 2 m de la mal. Pentru deseurile
provenite din prelucrarea cartofilor sau pentru apele reziduale, se
colectează probe din punctul de deversare a acestora. Mărimea
recomandată a probelor poate atinge 500 ml pe punct de prelevare. În cazul
în care se preferă probe mai mici, se recomandă prelevarea probelor
cel putin în 3 reprize pe punct de prelevare, fiecare probă constând din
două subprobe duplicate de cel putin 30 ml. Pentru un studiu intensiv, se
selectionează cel putin 3 puncte de prelevare pentru 3 km de curs al apei
si se prelevă si din afluentii cursului de apă.
2.1.2. Se transportă probele în conditii de
refrigerare (4-10°C) si la întuneric si se testează pe parcursul a 24 de
ore.
2.1.3. La nevoie, probele pot fi concentrate prin una
dintre următoarele metode:
a) se centrifughează 30-50 ml de subprobă la
10.000 g timp de 10 minute (sau la 7.000 g timp de 15 minute), preferabil la
4-10°C, se îndepărtează supernatantul, iar sedimentul se
resuspendă în 1 ml de tampon concentrat (vezi apendicele 4).
b) Filtrare pe membrană (dimensiunea minimă a
porilor, de 0,45 um) urmată de spălarea filtratului în 5-10 ml de
tampon concentrat si retinerea solutiilor de spălare. Această
metodă este adecvată pentru volume mari de probe de apă, cu
continut mic de organisme saprofite.
În general, concentrarea nu se recomandă pentru
probele de deseuri provenite din prelucrarea cartofilor sau din ape reziduale,
dat fiind faptul că populatiile mai mari de bacterii saprofite concurente
vor avea un efect inhibitor asupra detectiei bacteriei Ralstonia
solanacearum.
2.2. Teste
A se vedea diagrama si descrierea testelor în apendicii
corespunzători.
(1) A
se vedea sectiunea IV.2.1 pentru procedurile de prelevare recomandate.
(2)
Metodele de concentrare a agentului patogen sunt descrise în sectiunea IV.2.1.
Concentrarea sporeste populatiile agentului patogen si ale bacteriilor
saprofite concurente si este recomandată numai în cazul în care nu
determină inhibarea testului de izolare.
(3) Testul
de izolare selectivă este descris în sectiunea VI.A.4.
(4)Testul
biologic este descris în sectiunea VI.A.9.
(5)
Metodele de îmbogătire PCR sunt descrise în sectiunile VI.A.4.2 si VI.A.6.
(6)
Metodele de îmbogătire EUSAsunt descrise în sectiunile VI.A.4.2 si VI.A.8.
(7)
Morfologia tipică a coloniei este descrisă în sectiunea ll.3.d).
(8)
Cultivarea riscă să esueze din cauza concurentei sau a efectului
inhibitor al bacteriilor saprofite. Tn cazul în care populatiile mari de
saprofite sunt suspectate că ar putea afecta fiabilitatea izolării,
testele de izolare trebuie reîncepute după diluarea probei în apă
sterilă.
(9)
Identificarea fiabilă a culturilor pure de izolate prezumtive de Ralstonia
solanacearum necesită efectuarea testelor descrise la sectiunea VI.B.
(™) Testul de patogenitate este descris în sectiunea VI.C.
SECTIUNEA a V-a
1. Procedură
pentru detectia si identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în sol
(1)A
se vedea pct. V.2.1 pentru procedurile de prelevare recomandate.
(2)
Testul de izolare selectivă este descris fn sectiunea VI.A.4.
(3)
Metodele de îmbogătire PCR sunt descrise în sectiunile VI.A.4.2 si VI.A.6.
(4)Testul biologic este descris în sectiunea VI.A.9.
(5)
Morfologia tipică a coloniei este descrisă în sectiunea ll.3.d.
(6)
Cultivarea riscă să esueze din cauza concurentei sau a efectului
inhibitor al bacteriilor saprofite. In cazul în care populatiile mari de
bacterii saprofite sunt suspectate că ar putea afecta fiabilitatea
izolării, testele de izolare trebuie reîncepute după o nouă
dilutie a probei.
(7)
Identificarea fiabilă a culturilor pure prezumtive de Ralstonia
solanacearum necesită efectuarea testelor descrise la sectiunea VI.B. WTestul de patogenitate este descris în sectiunea
VI.C.
2. Metode
pentru detectia si identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în sol
Principii
Procedura de detectie validată descrisă în
prezenta sectiune se aplică pentru detectia agentului patogen în probe de
sol, dar poate fi, de asemenea, utilizată pentru a testa probele de
deseuri solide provenite din prelucrarea cartofilor sau a nămolului de
epurare. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că aceste metode nu
sunt destul de sensibile pentru a garanta detectia populatiilor de Ralstonia
solanacearum cu densitate mică sau dispersate inegal, care ar putea
apărea în probele infectate în mod natural cu aceste substraturi.
Limita de sensibilitate a acestei proceduri de testare
trebuie avută în vedere la evaluarea fiabilitătii rezultatelor
negative obtinute si, de asemenea, la utilizarea sa în studiile destinate
să stabilească prezenta ori absenta agentului patogen în soluri sau
în nămol. Cel mai fiabil test de detectie a prezentei agentului patogen în
solul unui câmp este plantarea unei plante-gazdă sensibile si supravegherea
infectării eventuale a acesteia, însă nici această metodă
nu va permite detectia unui nivel slab de contaminare.
2.1. Pregătirea probei
2.1.1. Prelevarea solului din câmp trebuie să
respecte standardele de bază utilizate pentru prelevarea nematozilor. Se
colectează 0,5-1 kg de sol per probă în 60 de puncte, pe o
suprafată de 0,3 ha, la o adâncime de 10-20 cm (sau dintr-o grilă de
7 x 7 m). În cazul în care se suspectează prezenta agentului patogen, se
măreste numărul de puncte de colectare la 120 pe o suprafată de
0,3 ha. Înainte de testare, probele se păstrează la o
temperatură de 12-15°C. Se colectează în total 1 kg de nămol
provenit din prelucrarea cartofilor si nămol de epurare în locurile care
reprezintă volumul total de nămol de testat. Înainte de testare,
fiecare probă se amestecă bine.
2.1.2. Se împart probele în subprobe de 10-25 g de sol
sau de nămol cu ajutorul unui agitator rotativ (250 turatii/minut) în
tampon de extractie de 60-150 ml (apendice 4) timp de două ore cel mult.
După caz, pentru a favoriza dispersia, se adaugă 0,02 % de Tween 20
steril si 10-20 g de μletris steril.
2.1.3. Suspensia se păstrează, în timpul
testului, la 4°C. 2.2. Teste
A se vedea diagrama si descrierea testelor în apendicii
corespunzători.
SECTIUNEA a Vl-a
Protocoale optimizate pentru detecpa si identificarea
bacteriei Ralstonia solanacearum
A. DIAGNOSTIC Sl TESTE DE DETECTIE
1. Testul
eliminării exudatului bacterian din tulpină
Prezenta bacteriei Ralstonia solanacearum în
tulpini ofilite de cartof, tomate sau de alte plante-gazdă poate fi
pusă în evidentă prin următorul test simplu prezumtiv: se
sectionează
tulpina chiar deasupra
nivelului solului. Se suspendă extremitatea tăiată într-un tub
cu apă curată. După câteva minute se observă scurgeri
spontane si caracteristice de fire de exudat bacterian din fasciculele
vasculare tăiate.
2. Detectia
granulelor de poli-B-hidroxibutirat
1. Se prepară un frotiu din exudatul bacterian scurs
din tesutul infectat pe o lamă de microscop sau se prepară un frotiu
dintr-o cultură de 48 de ore de pe mediu YPGA sau SPA (apendice 2).
2. Se prepară frotiuri de control pozitiv din
culturi de Ralstonia solanacearum biovar 2 si, în cazul în care se
consideră necesar, un frotiu de control negativ cunoscut PHB negativ.
3. Se lasă la uscat si se trece rapid partea
inferioară a fiecărei lame de câteva ori prin flacără
până la fixarea frotiului.
4. Se colorează frotiul preparat cu albastru de Nil
sau negru de Sudan si se examinează la microscop după cum
urmează.
Testul cu albastru de Nil
a) Fiecare lamă se scufundă într-o solutie
apoasă 1 % de albastru de Nil A si se incubează 10 minute la 55°C.
b) Se scurge solutia colorantă. Se spală rapid
sub jet de apă. Excesul de apă se îndepărtează cu hârtie
absorbantă.
c) Frotiul se scufundă într-o solutie apoasă de
acid acetic de 8 % si se incubează un minut la temperatura ambiantă.
dj Se spală rapid sub jet de apă. Excesul de
apă se îndepărtează cu hârtie absorbantă.
e) Se umezeste cu o μlcătură de apă
si se aplică o lamelă de acoperire.
f) Se examinează frotiul colorat la un microscop cu
epifluorescentă de 450 nm cu ulei de imersie, la o mărire de
600-1.000, folosindu-se un obiectiv de imersie în ulei sau în apă.
g) Se observă fluorescenta portocalie
strălucitoare a granulelor PHB. De asemenea, se observă la
lumină albă pentru a avea certitudinea că granulele sunt
intracelulare si că morfologia celulei este tipică pentru Ralstonia
solanacearum.
Testul cu negru de Sudan
a) Fiecare lamelă se scufundă într-o solutie de
0,3 % negru de Sudan B în 70 % etanol si se incubează 10 minute la
temperatura ambiantă.
b) Se scurge solutia colorantă si se spală
rapid sub jet de apă. Se îndepărtează excesul de apă cu
hârtie absorbantă.
c) Lamele se trec rapid prin xilol si se usucă cu
hârtie absorbantă. Atentie! Xilolul este un produs periculos. Luati
măsurile de precautie necesare si lucrati într-o hotă chimică.
d) Se scufundă lamele în solutie apoasă de
safranină 0,5 % si se lasă 10 secunde la temperatura ambiantă. Atentie!
Safranină este un produs periculos. Luati măsurile de precautie
necesare si lucrap într-o hotă chimică.
e) Se spală sub jet de apă. Se usucă cu
hârtie absorbantă si se acoperă cu o lamelă.
f) Se examinează frotiul colorat la un microscop
optic, folosindu-se obiectivul de imersie la o mărire de 1.000.
g) Se observă granulele de PHB în celulele de Ralstonia
solanacearum care se colorează în albastru-negru. Membrana
celulară se colorează în roz.
3. Teste
serologice de aglutinare
Aglutinarea celulelor de Ralstonia solanacearum în
exudatul bacterian sau în extractele de tesuturi simptomatice se observă
cel mai bine folosindu-se anticorpi validati (vezi apendice 3) etichetati cu
markeri colorati corespunzători, precum celulele de Staphylococcus
aureus rosu sau particule de latex colorate. În caz de utilizare a unui
material disponibil în comert (vezi apendice 3), se urmează instructiunile
producătorului, tn caz contrar, se urmează procedura descrisă în
continuare:
a) Se amestecă μlcăturile unei suspensii
de anticorpi si de exudat bacterian marcate (circa 5 μl în fiecare caz) pe
ferestrele lamelor detestare cu multe godeuri;
b) Se prepară suspensii de control pozitiv si
negativ din suspensii de Ralstonia solanacearum biovar 2 si dintr-o
tulpina heterologă;
c) Se observă aglutinarea în probele pozitive
după o omogenizare usoară timp de 15 secunde.
4. Izolarea
pe mediu selectiv
4.1. fnsământare pe mediu selectiv
notA: înainte de aplicarea acestei metode pentru prima
dată, se efectuează teste preliminarii pentru a garanta o detectie
reproductibilă a 103-104 celule formatoare de
coloniu (cfu) per ml de Ralstonia solanacearum adăugată la
extractele care au dat rezultate negative la testele anterioare.
Se foloseste un mediu selectiv validat
corespunzător, de exemplu, SMSA (modificat de Elphinstone ef al., 1996;
vezi apendicele 2).
De asemenea, trebuie diferentiată Ralstonia
solanacearum de alte bacterii care pot dezvolta colonii în mediul
respectiv. În plus, coloniile de Ralstonia solanacearum pot prezenta o
morfologie atipică în cazul în care plăcile sunt suprapopulate sau în
cazul în care sunt, de asemenea, prezente bacterii antagoniste. În cazul în
care se suspectează efectele de concurentă sau de antagonism, proba
trebuie testată din nou, utilizându-se o metodă de testare
diferită.
Cea mai mare sensibilitate de detectie, în cadrul acestei
metode, poate fi atinsă în cazul în care se folosesc extracte de probe
proaspăt preparate. Cu toate acestea, metoda se aplică, de asemenea,
extractelor cu glicerol păstrate la o temperatură cuprinsă între
- 68 si - 86°C.
Se prepară, pentru control pozitiv, dilutii zecimale
de suspensie de 106 ufc/ml dintr-o tulpină virulentă
biovar 2 de Ralstonia solanacearum (de exemplu, NCPPB 4156 = PD 2762 =
CFBP 3857). Pentru a se evita orice posibilitate de contaminare, controalele
pozitive se prepară complet separat de probele de testat.
Pentru fiecare lot de mediu selectiv proaspăt
pregătit, acesta trebuie testat pentru a se vedea dacă este propice
înmultirii agentului patogen înainte de a-l utiliza pentru testarea probelor de
rutină.
Materialul de control se testează în acelasi mod ca
si probele.
4.1.1. Testul se efectuează cu ajutorul unei tehnici
corespunzătoare de însământare cu scopul de a asigura diluarea
întregii populatii care formează colonii de saprofite. Se
însământează 50-100 μl din fiecare probă de extract si
fiecare dilutie.
4.1.2. Plăcile se incubează la 28°C. Citirea
plăcilor se face după 48 de ore, iar apoi zilnic pe o perioadă
de până la 6 zile. Coloniile tipice de Ralstonia solanacearum în
mediul nutritiv SMSA sunt de culoare alb-lăptos, plate, neregulate si
fluide, iar după 3 zile de incubare dezvoltă o coloratie roz spre
rosu-sângeriu în centru, prezentând spirale sau striatii interne sau verticile
(a se vedea website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/i rc/sanco/Home/main).
notă: Uneori, în acest mediu se formează colonii atipice
de Ralstonia solanacearum. Ele pot fi mici, în întregime de culoare
rosie si nefluide sau partial fluide, fiind, prin urmare, greu de deosebit de
bacteriile saprofite care formează colonii.
4.1.3. Coloniile prezumtive de Ralstonia solanacearum se
purifică după însământare si însământare pe mediu nutritiv
general pentru a obtine colonii izolate (a se vedea apendicele 2).
4.1.4. Culturile pot fi păstrate pe termen scurt în
apă sterilă (pH 6-8, fără clor) la temperatura
ambiantă la întuneric sau pe termen lung într-un mediu crioprotector
corespunzător între - 68 si - 86°C sau liofilizate.
4.1.5. Se identifică culturile prezumtive (vezi
sectiunea VI. B)
si se efectuează un test de patogenitate (vezi sectiunea VI.
C).
Interpretarea rezultatelor testului de izolare pe mediu
selectiv
Testul de însământare pe mediu selectiv este negativ
atunci când după 6 zile nu sunt observate colonii bacteriene sau atunci
când nu sunt observate colonii caracteristice Ralstonia solanacearum, cu
conditia să nu fie suspectată o inhibitie datorată competitiei
sau antagonismului cu alte bacterii si în cazul controalelor pozitive să
fie observate colonii caracteristice de Ralstonia solanacearum.
Testul de însământare pe mediu selectiv este pozitiv
atunci când sunt observate colonii prezumtive de Ralstonia solanacearum.
4.2. Procedura de îmbogătire
A se utiliza un mediu de îmbogătire validat precum
mediul nutritiv modificat Wilbrink (a se vedea apendicele 2).
Această procedură poate fi folosită pentru
a creste în mod selectiv populatiile de Ralstonia solanacearum în probe
si pentru a creste sensibilitatea detectiei Procedura permite, de asemenea,
diluarea eficientă a inhibitorilor reactiei PCR (1:100). Cu toate acestea,
trebuie notat faptul că îmbogătirea bacteriei Ralstonia
solanacearum poate esua din cauza concurentei sau antagonismului
organismelor saprofite care sunt de multe ori îmbogătite simultan. În
consecintă, izolarea bacteriei Ralstonia solanacearum pe medii
nutritive de cultură îmbogătite poate fi dificilă. De asemenea,
întrucât populatiile de saprofite apropiate din punct de vedere serologic se
pot înmulti, în cazul utilizării testului ELISA, se recomandă
utilizarea de anticorpi monoclonali specifici în locul anticorpilor policlonali.
4.2.1. îmbogătirea pentru PCR presupune transferul a
100 μl de extract de probă în 10 ml de mediu nutritiv lichid de
îmbogătire (apendicele 2) alicotat anterior în tuburi sau flacoane
fără urme de ADN. Pentru îmbogătirea ELISA, se pot folosi proportii
mai mari de mediu nutritiv lichid (de exemplu, 100 μl în 1,0 ml de mediu
nutritiv lichid de îmbogătire).
4.2.2. Se incubează timp de 72 de ore între 27 si
30°C într-o cultură agitată sau statică fără a închide
ermetic dopul tubului, pentru a permite aerisirea.
4.2.3. Se amestecă bine înainte de a se utiliza
pentru testele ELISA sauPCR.
4.2.4. În testele anterioare, mediul nutritiv lichid de
îmbogătire se tratează în acelasi mod ca si probele.
notă: În cazul în care se prevede o inhibitie a
îmbogătirii bacteriei Ralstonia solanacearum din cauza populatiilor
considerabile de anumite bacterii saprofite concurente, îmbogătirea
extractelor de probe înainte de centrifugare sau alte etape de concentrare pot
determina obtinerea unor rezultate mai bune.
5. Testul
de imunofluorescentă
Principiu
Tinându-se seama de capacitatea sa recunoscută de a
atinge pragurile impuse, se recomandă utilizarea testului de
imunofluorescentă ca principal test de detectie rapidă.
În cazul în care testul de imunofluorescentă este utilizat
ca principal test detectie rapidă si rezultatul lui este pozitiv, trebuie
efectuat un test de izolare, uri test PCR sau un test FISH drept test secundar.
În cazul în care testul de imunofluorescentă este utilizat ca test
secundar si rezultatul lui este pozitiv, analiza trebuie completată cu
teste suplimentare după cum prevede diagrama functională.
notă: Se utilizează o sursă validată de
anticorpi de Ralstonia solanacearum (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main
). Se recomandă stabilirea titrului pentru fiecare lot nou de anticorpi.
Titrul se defineste ca fiind cea mai mare dilutie la care se obtine o reactie
optimă atunci când se testează o suspensie de 105-106
celule pe ml din tulpina omologă de Ralstonia solanacearum foiosindu-se
un conjugat corespunzător de izotiocianat de fluoresceină (FITC), în
conformitate cu recomandările producătorului. Toate an ti serurile
policlonale validate au un titru de imunofluorescentă de cel putin 1:
2.000. La efectuarea testului, dilutiile de lucru ale anticorpilor trebuie
să fie aproximativ egale sau egale cu cele ale titrului.
Testul trebuie efectuat cu extracte de probe
proaspăt preparate. După caz, se pot folosi si extracte conservate în
solutie de glicerol la o temperatură cuprinsă între - 68°C si -86°C.
Glicerolul poate fi separat de probă prin adăugarea a 1 ml de tampon
concentrat (vezi apendicele 4), recentrifugarea timp de 15 minute la 7.000 g si
resuspendarea în acelasi volum de tampon concentrat. Acest lucru este rareori
necesar, mai ales atunci când probele sunt fixate de lame prin flambare.
Separat se prepară lame de control pozitiv dintr-o
tulpină omologă sau orice altă tulpină de referintă de
Ralstonia solanacearum în suspensie în extract de cartof, după cum
prevede apendicele 3 B, si, facultativ, în tampon.
În cazul în care este posibil, ar trebui să se
folosească drept control similar pe aceeasi lamă tesut infectat în
mod natural (conservat prin liofilizare sau congelare la o temperatură
între -16 si - 24°C).
În calitate de control negativ, se pot folosi alicote de
extracte de probe care au dat rezultate negative la testele anterioare de
detectie a bacteriei Ralstonia solanacearum.
Materialele de control pozitiv si negativ standardizate
disponibile pentru acest test sunt prevăzute în apendicele 3.
Se folosesc pentru microscop lame cu multe godeuri,
având, de preferintă, 10 ferestre cu diametru de cel putin 6 mm.
Materialul de control se testează în acelasi mod ca
si probele.
5.1. Lamele-test se prepară folosiridu-se una dintre
următoarele metode:
(i) Extracte concentrate cu relativ putin amidon:
Se μlpetează un volum standard (15 μl este
adecvat unui godeu de 6 mm diametru - volumul se măreste pentru godeuri cu
diametru mai mare) dintr-o dilutie de 1/100 de sediment resuspendat în primul
godeu. Apoi se μlpetează un volum similar de sediment nediluat (1/1)
în godeurile rămase din primul rând al lamei. Al doilea rând poate fi
folosit ca duplicat sau pentru o a doua probă, în conformitate cu cele
indicate în figura 1.
(ii) Pentru alte extracte concentrate:
Se pregătesc dilutii zecimale (1/10,1/100) din
sedimentul resuspendat în tampon concentrat. Se μlpetează un volum
standard (15 μl este adecvat unui godeu de 6 mm diametru - volumul se
măreste pentru godeuri cu un diametru mai mare) din sedimentul resuspendat
si din fiecare dilutie pe un rând de godeuri. Al doilea rând poate fi folosit
ca duplicat sau pentru o a doua probă, în conformitate cu cele prezentate
în figura 2.
5.2. Se lasă μlcăturile să se usuce
la temperatura ambiantă sau prin încălzire la o temperatură de
40-45°C. Celulele bacteriene se fixează pe lamă fie prin
încălzire (15 minute la 60CC), trecere prin flacără,
cu 95 % etanol sau în conformitate cu instructiunile specifice ale furnizorilor
de antiseruri.
în cazul în care este necesar, lamele fixate pot fi
stocate la congelator într-o cutie uscată, atât cât este necesar (cel mult
3 luni), înainte de un nou test.
5.3. Procedura testului de imunofluorescentă
(i) în conformitate cu metoda de pregătire a
lamelor-test indicată la pct. 5.1 (i):
Se prepară un set de dilutii de 1/2. În primul godeu
dilutia ar trebui să fie de 1/2 din titru (T/2), celelalte fiind de 1/4
din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titru (T) si de două ori titrul
(2T). (ii) în conformitate cu metoda de pregătire a lamelor-test
indicată la punctul 5.1 (ii):
Se prepară dilutia de lucru a anticorpilor în tampon
IF.
Dilutia de lucru are efect asupra specificitătii.
Figura 1: Pregătirea lamei-test în conformitate cu
pct. 5.1 (i) si 5.3 (i)
Dilutii ale extractului concentrat resuspendat
|
|
1/100 |
1/1 |
1/1 |
1/1 |
1/1 |
Dilutii ale
extractului concentrat resuspendat |
|
(T = titru) |
T/2 |
T/4 |
T/2 |
T |
2T |
Dilutii duble ale
antiserului/anticorpilor |
|
Proba 1 |
• |
• |
• |
• |
• |
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
duplicat proba 1
sau proba 2 |
• |
• |
• |
• |
• |
|
|
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
Figura 2: Pregătirea lamei-test în conformitate cu
pct. 5.1 (ii) si 5.3 (ii)
Dilutie de lucru a antiserului/anticorpilor
|
|
|
|
|
|
Dilutie
zecimală a sedimentului resuspendat |
|
1/1 |
1/10 |
1/100 |
gol |
gol |
|
|
Proba 1 |
• |
• |
• |
• |
• |
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
duplicat proba 1
sau proba 2 |
• |
• |
• |
• |
• |
|
|
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
5.3.1. Lamele se asază pe hârtie absorbantă
umedă. Se acoperă complet fiecare godeu de test cu dilutia sau
dilutiile de anticorpi. Volumul de antiser μlpetat în fiecare godeu
trebuie să fie cel putin echivalent cu volumul de extract μlpetat pe
lamă.
Următoarea procedură ar trebui aplicată în
absenta instructiunilor specifice ale furnizorilor de anticorpi:
5.3.2. Se incubează lamele pe hârtie umedă
acoperite timp de 30 de minute la temperatura ambiantă (18-25°C).
5.3.3. Se îndepărtează antiserul de pe fiecare
lamă si se spală lamele cu atentie cu tamponul IF. Se spală prin
imersare în solutie tampon IF-Tween (apendice 4) timp de 5 minute si apoi în
tampon IF. Se evită formarea de aerosoli sau transferul de
μlcături care ar putea conduce la o contaminare încrucisată.
Excesul de tampon IF se îndepărtează cu grijă cu o hârtie de
filtru.
5.3.4. Lamele se asază pe hârtie umedă. Se
acoperă godeurile lamelor-test cu dilutii ale conjugatului FITC utilizat
pentru determinarea titrului. Volumul de conjugat μlpetat în godeuri
trebuie să fie egal cu volumul de anticorpi μlpetat.
5.3.5. Se incubează lamele pe hârtie umedă,
acoperite, timp de 30 de minute la temperatura ambiantă (18-25°C).
5.3.6. Se îndepărtează conjugatul de pe
lamă. Se spală în conformitate cu cele indicate anterior (pct.
5.3.3). Se îndepărtează cu grijă excesul de tampon IF.
5.3.7. Se μlpetează 5-10 ui tampon glicerol
fosfat 0,1 M (apendicele 4) sau o altă solutie antidecolorare de montare
comercială în fiecare godeu si se acoperă cu o lamelă.
5.4. Citirea testului de imunofluorescentă
5.4.1. Se examinează lamele-test la un microscop cu
sursă de lumină epifluorescentă si cu filtre adaptate pentru a
lucra cu izotiocianat de fluoresceină, cu ulei de imersie sau în apă,
la o mărire de 500-1.000. Se examinează godeurile pe două
diametre în unghi drept si de-a lungul perimetrului. Pentru probele
fără celule sau cu un număr redus de celule se examinează
cel putin 40 câmpuri microscopice.
Se verifică mai întâi lama de control pozitiv. Celulele
trebuie să fie intens fluorescente si colorate complet la titrul de
anticorpi sau la dilutia de lucru determinată. Testul IF (pct. 5) trebuie
repetat în cazul în care apare o coloratie anormală.
5.4.2. Se caută prezenta celulelor intens
fluorescente cu morfologie caracteristică bacteriei Ralstonia
solanacearum în godeurile lamelor-test (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensitatea fluorescentei
trebuie să fie echivalentă cu cea a tulpinii de control pozitiv la aceeasi
dilutie de anticorpi. Celulele cu coloratie incompletă sau cu
fluorescentă slabă nu trebuie luate în considerare.
În cazul în care se suspectează o contaminare,
testul trebuie repetat. Acest lucru se poate întâmpla atunci când în toate
lamele unei serii de analize se observă celule pozitive din cauza unei
contaminări a tamponului sau atunci când celulele pozitive se observă
în afara godeurilor.
5.4.3. Există un anumit număr de probleme care
afectează specificitatea testului de imunofluorescentă. La nivelul
conurilor de tesut vascular si în bucătile de tulpini pot apărea
populatii de celule fluorescente atipice din punct de vedere morfologic, precum
si bacterii saprofite care pot conduce la reactii încrucisate, având
mărime si morfologie asemănătoare cu Ralstonia solanacearum.
5.4.4. Trebuie luate în considerare numai celulele
fluorescente ale căror dimensiune si morfologie sunt caracteristice
titrului sau dilutiei de lucru a anticorpilor mentionati la pct. 5.3.
5.4.5. Interpretarea testului IF:
(i) în cazul în care se observă celule intens
fluorescente cu morfologie caracteristică, se determină numărul
mediu de celule tipice pe câmp microscopic si se calculează numărul
de celule tipice pe ml de sediment resuspendat (apendice 5).
Testul de imunofluorescentă se consideră ca
fiind pozitiv pentru probele care contin cel putin 5 x 103 celule
tipice pe ml de sediment resuspendat. Proba se consideră ca fiind
potential contaminată, fiind necesare mai multe testări, (ii) Testul
de imunofluorescentă se consideră ca fiind negativ pentru probele
care contin mai putin de 5 x 103 celule pe ml de sediment
resuspendat. Proba se consideră ca fiind negativă, efectuarea altor
teste nefiind obligatorie.
6. Testele PCR
Principii
în cazul în care testul PCR se foloseste drept test
principal de detectie, iar rezultatul acestuia este pozitiv, trebuie efectuat
un test de izolare sau un test de imunofluorescentă drept al doilea test
de detectie obligatoriu. În cazul în care testul PCR se foloseste ca test
secundar, iar rezultatul este pozitiv, diagnoza trebuie completată cu
teste suplimentare, după cum indică diagrama functională.
O exploatare completă a acestei metode ca test
principal de detectie se recomandă numai atunci când se dobândeste o
expertiză specializată în domeniu.
notă: Testele preliminarii realizate în conformitate cu
această metodă trebuie să permită detectia
reproductibilă a 103-104 celule pe ml de Ralstonia
solanacearum adăugate extractelor de probe care au dat anterior
rezultate negative. Poate fi necesară efectuarea unor experimente de
optimizare în toate laboratoarele pentru a obtine niveluri maxime de
sensibilitate si de specificitate.
Se folosesc reactivi si protocoale PCR validate (vezi
apendice 6). Se alege, de preferintă, o metodă care să
contină un control intern.
Se iau măsurile de precautie necesare pentru a se
evita contaminarea probei cu ADN-tintă. Testul PCR ar trebui realizat de
tehnicieni experimentati în laboratoare de biologie moleculară
specializate, pentru a se reduce cât mai mult posibilitatea contaminării
cu ADN-tintă.
Controalele negative (pentru procedurile de extractie de
ADN si amplificare PCR) ar trebui tratate întotdeauna ca probe finale în
procedură, pentru a indica o eventuală aparitie a unui transfer de
ADN.
Următoarele controale negative ar trebui incluse în
testul PCR:
- extractul probei care a produs anterior rezultate
negative pentru depistarea Ralstonia solanaceamm;
- tampoanele
utilizate pentru extractia ADN din probă;
- amestecul de reactivi pentru PCR. Următoarele
controale pozitive ar trebui incluse:
- alicote de sedimente resuspendate la care s-a
adăugat Ralstonia solanacearum (preparare: vezi apendice 3 B);
- suspensie de 106 celule pe ml dintr-un
izolat virulent de Ralstonia solanacearum în apă (de exemplu, NCPPB
4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vezi apendice 3 B);
- atunci când este posibil, se foloseste, de asemenea, în
testul PCR, ADN extras din probe pozitive în testul PCR.
Pentru a se evita o eventuală contaminare,
controalele pozitive se prepară într-un mediu diferit de cel al probelor
de testat.
Extractele probelor trebuie curătate, atât cât este
posibil, de particulele de sol. În anumite cazuri, atunci când se prevede
utilizarea protocoalelor PCR, ar putea fi recomandabil să se prepare
extracte de tuberculi de cartofi spălati.
Materialele de control pozitiv si negativ standardizate,
disponibile pentru utilizare în acest test, sunt prevăzute în apendicele
3.
6.1. Metode de purificare a ADN-ului
Se folosesc controale pozitive si negative în
conformitate cu metoda descrisă anterior (vezi apendicele 3).
Controalele se testează în acelasi mod cu probele.
Există o serie de metode de purificare a
ADN-tintă din substraturile de probe complexe, ce permit eliminarea
inhibitorilor PCR si a altor reactii enzimatice si concentrează ADN-ul
tintă din probă. Următoarea metodă a fost optimizată
pentru utilizare în cadrul metodelor PCR validate indicate în apendicele 6.
a) Metoda Pastrik (2000)
(1) Se μlpetează 220 μl de tampon de
liză [100 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] într-un
tub Eppendorf de 1,5 ml.
(2) Se adaugă 100 μl de extract de probă
si se introduce într-un bloc de încălzire sau în baie de apă la 95°C
timp de 10 minute.
(3) Se asază tubul pe gheată timp de 5 minute.
(4) Se adaugă 80 ui de solutie concentrată de lizozim
(50 mg de lizozim pe ml în 10 mM Tris-HCI, pH 8,0) si se incubează la 37°C
timp de 30 de minute.
(5) Se adaugă 220 μl de solutie A de Easy DNA®
(Invitrogen), se amestecă bine prin vortexare si se incubează la 65°C
timp de 30 de minute.
(6) Se adaugă 100 μl de solutie B de Easy DNA®
(Invitrogen), se omogenizează bine prin vortexare până când
precipitatul circulă liber în tub, iar proba are o consistentă
uniform-vâscoasă.
(7) Se adaugă 500 μl de cloroform si se
omogenizează prin vortexare până când vâscozitatea este redusă
si amestecul este omogeiL
(8) Se centrifughează la 15.000 g timp de 20 de
minute la 4°C pentru a separa fazele si a forma interfaza.
(9) Faza superioară se transferă într-un nou
tub Eppendorf.
(10) Se adaugă 1 ml de etanol 100 % (- 20°C), se
omogenizează scurt prin vortexare si se incubează pe gheată timp
de 10 minute.
(11) Se centrifughează la 15.000 g timp de 20 de
minute la 4°C si se îndepărtează etanolul din extractul concentrat.
(12) Se adaugă 500 μl de etanol 80 % (- 20°C)
si se amestecă prin răsturnare.
(13) Se centrifughează la 15.000 g timp de 10 minute
la 4°C, se păstrează sedimentul si se îndepărtează
etanolul.
(14) Sedimentul se lasă să se usuce în aer
liber sau într-un SpeedVacADN.
(15) Sedimentul se repune în suspensie în 100 μl de
apă ultrapură sterilă si se lasă la temperatura
ambiantă timp de cel putin 20 de minute.
(16) Se depozitează la - 20°C până când
extractul este necesar pentru PCR.
(17) Înainte de utilizare se centrifughează, pentru
reactia de amplificare prin PCR fiind necesari 5 μl de supernatant
continând ADN.
b) Alte metode
Pot fi utilizate si alte metode de extractie a ADN, de
exemplu Qiagen DNeasy Plant Kit, cu conditia ca acestea să aibă o
eficacitate echivalentă de purificare a ADN-ului din controalele pozitive
cu un continut de 103-104 celule patogene per ml.
6.2. Amplificare PCR
6.2.1. Se pregătesc extractele de ADN de testat si
controalele în conformitate cu protocoalele validate (pct. 6). Se prepară
o dilutie decimală din extractul de probă de ADN (1:10 în apă
ultrapură).
6.2.2. Se prepară amestecul reactiv (mixul de
amplificare) corespunzător pentru PCR într-un mediu necontaminat în
conformitate cu protocoalele publicate (apendice 6). În cazul în care este
posibil, se recomandă utilizarea unui protocol PCR multiplex care include
un control intern al reactiei PCR.
6.2.3. Se adaugă 2-5 μl de extract de ADN pe 25
μl mix PCR în tuburi PCR sterile în conformitate cu protocoalele PCR (vezi
apendicele 6).
6.2.4. Se include un control negativ continând numai mix
de amplificare si se adaugă apă ultrapură, din aceeasi
sursă cu cea utilizată pentru mixul de amplificare PCR, în locul
probei.
6.2.5. Tuburile se introduc în acelasi termociclor
utilizat la testul preliminar si se lansează programul PCR optimizat în
mod corespunzător (apendice 6).
6.3. Analiza produsului reactiei PCR (amplicon)
6.3.1. Fragmentele PCR sunt detectate prin
electroforeză în gel de agaroză. Se pune sub tensiune la 5-8 V/cm o
cantitate de cel putin 12 μl de ADN amplificat din fiecare probă la care
se adaugă 3 μl de tampon de încărcare (apendice 6) în gel de
agaroză 2 % într-un tampon tris-acetat-EDTA (TAE) (vezi apendicele 6). Se
foloseste un marker de ADN corespunzător mărimii asteptate a
ampliconului, precum cel de 100 bp.
6.3.2. Pentru vizualizarea fragmentelor de ADN, se
recurge la colorare cu bromură de etidiu (10,5 mg/l) timp de 30-60 de
minute, luându-se măsurile de precautie necesare pentru manipularea
acestui agent mutagen.
6.3.3. În cazul unor produse PCR având mărimea
asteptată (vezi apendicele 6), gelul colorat se vizualizează prin
iluminare ultravioletă cu unde scurte (A = 302 nm) si se notează
rezultatele.
6.3.4. Pentru noile cazuri sau constatări, se
verifică autenticitatea fragmentului amplificat PCR, efectuându-se o
analiză de restrictie enzimatică pe o probă de ADN
amplificată rămasă. În acest scop, ADN-ul amplificat rămas
se incubează la o temperatură optimă si pe o perioadă
optimă cu o enzimă si un tampon
corespunzător (vezi apendicele 6). Fragmentele restrictate se
detectează prin electroforeză în gel de agaroză si colorare cu
bromură de etidiu în conformitate cu metoda descrisă anterior.
Dispunerea tipică a fragmentelor după analiza de restrictie
enzimatică se vizualizează prin iluminare ultravioletă.
Fragmentele de ADN se compară cu tulpinile de control pozitiv înainte si
după restrictie.
Interpretarea rezultatului testului PCR
Testul PCR este negativ atunci când produsul PCR specific
pentru Ralstonia solanacearum cu dimensiunea asteptată nu este
detectat pentru proba respectivă, iar pentru ansamblul de probe, în cazul
unui multiplex PCR cu primeri de control intern specific plantei, un al doilea
produs PCR cu dimensiunea asteptată trebuie să fie amplificat cu
probele respective.
Testul PCR este pozitiv în cazul în care produsul PCR
caracteristic de Ralstonia solanacearum de dimensiunea si tipul de
restrictie (atunci când este restrictat) asteptate este detectat, cu conditia
să nu existe amplificare la probele de control negativ. Se poate obtine o
confirmare fiabilă a rezultatului pozitiv prin repetarea testului cu un al
doilea set de primeri PCR (apendicele 6).
NOTĂ:
Se poate suspecta o inhibitie a PCR în cazul în care fragmentul amplificat
prevăzut este obtinut în cazul controlului pozitiv de Ralstonia
solanacearum în apă, dar se obtin rezultate negative în cazul
controalelor pozitive continând R. solanacearum în extractul de cartof.
In protocoalele PCR compuse, cu control intern al PCR, se constată
inhibitia reactiei atunci când nu se obtine niciunul dintre cele două
fragmente amplificate.
Se poate suspecta o contaminare atunci când fragmentul
amplificat prevăzut este obtinut din unul sau mai multe controale
negative.
7. Testul FISH
Principiu
în cazul în care testul FISH se foloseste drept test
principal de detectie si rezultatul lui este pozitiv, trebuie efectuat un test
de izolare sau un test IF drept al doilea test obligatoriu de detectie. În
cazul în care testul IF se foloseste ca test secundar si rezultatul lui este
pozitiv, analiza trebuie completată cu teste suplimentare, după cum
indică diagrama functională.
NOTĂ:
Se folosesc oligosonde validate specifice pentru Ralstonia solanacearum (a
se vedea apendicele 7). Testele preliminare efectuate în conformitate cu
această metodă trebuie să permită o detectie
reproductibilă de 10M04 celule pe ml de Ralstonia
solanacearum adăugate la extractele de probe care au dat anterior
rezultate negative.
Este de preferat să se aplice procedura
descrisă în continuare extractelor de probe proaspăt preparate, dar
se pot folosi si extracte de probe conservate la temperaturi cuprinse între
-16°C si - 24°C sau între - 68°C si - 86°C.
Drept control negativ, se folosesc alicote de extracte de
probe care au dat anterior rezultate negative la testele de identificare a Ralstonia
solanacearum.
Drept control pozitiv, se folosesc suspensii continând 105-106
celule pe ml de Ralstonia solanacearum biovar 2 (de exemplu, tulpina
NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; a se vedea apendicele 3) preparate în tampon
fosfat 0,01 M (PB), dintr-o cultură de 3-5 zile. Separat, se prepară
lame de control pozitiv din tulpina omologă sau din orice altă
tulpină de referintă de Ralstonia solanacearum, în suspensie
în extract de cartof, în conformitate cu apendicele 3 B.
Controlul procesului de hibridizare se realizează
prin utilizarea unei oligosonde eubacteriene marcate cu izotiocianat de
fluoresceină (FITC) care colorează toate eubacteriile prezente în
probă.
Materialele de control pozitiv si negativ standardizate
disponibile pentru acest test sunt prevăzute în apendicele 3 A.
Materialul de control se testează în acelasi mod ca
si probele.
7.1. Fixarea extractului de cartof
Protocolul descris în continuare se bazează pe
Wullings ef al. (1998):
7.1.1. Se prepară solutia de fixare (a se vedea
apendicele 7).
7.1.2. Se μlpetează 100 μl din fiecare
extract de probă într-un tub Eppendorf si se centrifughează timp de 7
minute la 7.000 g.
7.1.3. Se îndepărtează supernatantul, iar
sedimentul se resuspendă în 200 μl de solutie de fixare
preparată cu mai putin de 24 de ore înainte. Se omogenizează prin
vortexare si se incubează timp de o oră în frigider.
7.1.4. Se centrifughează timp de 7 minute la 7.000
g, se îndepărtează supranatantul, iar sedimentul se resuspendă
în 75 μl de PB 0,01 M (a se vedea apendicele 7).
7.1.5. Se μlpetează 16 μl din suspensiile
fixate pe o lamă multitest curată, în conformitate cu figura 7.1. Pe
fiecare lamă se μlpetează două probe diferite, nediluate,
si 10 μl dilutie de 1:100 ale acestora (într-un tampon fosfat 0,01 M).
Restul suspensiei (49 μl) poate fi conservată la - 20°C după ce
i s-a adăugat un volum de etanol de 96 %. În cazul în care testul FISH trebuie
repetat, se elimină etanolul prin centrifugare si se adaugă un volum
echivalent de tampon fosfat 0,01 M (omogenizati prin vortexare).
Figura 7.1. Configuratia unei lame pentru testul FISH
|
Proba 1 |
martor |
martor |
martor |
Proba 2 |
|
o |
o |
o |
o |
o |
|
godeu 1 |
godeu 2 |
godeu 3 |
godeu 4 |
godeu 5 |
|
Proba 1 |
martor |
martor |
martor |
Proba 2 |
|
o |
o |
o |
o |
o |
|
Godeu 6 |
godeu 7 |
godeu 8 |
godeu 9 |
godeu 10 |
|
Lamela 1 |
|
Lamela 2 |
||
7.1.6. Se usucă lamele la temperatura ambiantă
(sau într-un uscător, la 37"C), apoi se fixează prin flambare.
Procedura de hibridizare poate fi întreruptă în
acest stadiu si continuată a doua zi. Lamele trebuie păstrate într-un
loc uscat, la temperatura ambiantă, ferite de praf.
7.2. Hibridizare
7.2.1. Se deshidratează celulele prin băi
succesive de etanol de 50 %, 80 % si 96 %, cu o durată de un minut
fiecare. Se aranjează lamele pe un suport si se lasă la uscat la
temperatura ambiantă.
7.2.2. Se realizează o cameră de incubare
umedă căptusind fundul unei cutii ermetice cu hârtie absorbantă
sau cu hârtie de filtru impregnată cu hibmix 1X (a se vedea apendicele 7).
Cutia se preincubează timp de cel putin 10 minute în incubatorul de
hibridizare la o temperatură de 45°C.
7.2.3. Se μlpetează 10 μl de solutie de
hibridizare (apendicele 7) în 8 godeuri (godeuri 1,2,4, 5, 6, 7, 9 si 10; vezi
figura 7.1) ale fiecărei lame, lăsând goale cele două godeuri
din mijloc (3 si 8).
7.2.4. Se acoperă cu lamele (24 x 24 mm) primul si
ultimele 4 godeuri, având grijă să nu prindă aer sub ele. Lamele
se introduc în camera umedă încălzită în prealabil si se
lasă timp de 5 ore în incubator la 45°C la întuneric, pentru hibridizare.
7.2.5. Se pregătesc 3 recipiente continând 1 I
de apă Milli Q
(biologie moleculară), 1 I de hibmix 1X în 334 ml de hibmix 3X si 666 ml de apă Milli Q (biologie
moleculară) si1 I de hibmix 1/8X în 42 ml de hibmix 3X si 958 ml de apă Milli Q
(biologie moleculară). Se preincubează fiecare recipient în baie de
apă la 45°C.
7.2.6. Se îndepărtează lamelele de pe lame si
se asază pe un suport de lame.
7.2.7. Se elimină excesul de probă prin
incubare timp de 15 minute la 45°C în recipientul cu hibmix 1X.
7.Z8. Se transferă suportul cu lame într-o solutie
de spălare cu hibmix 1/8X si se lasă la incubat timp de încă 15
minute.
7.2.9. Lamele se introduc scurt într-o baie de apă
Milli Q si se asază pe o hârtie de filtru. Se îndepărtează
umiditatea în exces tamponând usor suprafata umedă cu hârtie de filtru. Se
μlpeteazăîn fiecare godeu 5-10 μl de solutie antidecolorare (de
exemplu, Vectashield produs de Vecta Laboratories CA, USA, sau altă
solutie echivalentă) si se acoperă întreaga suprafată a lamei cu
o lamelă (24 x 60 mm).
7.3. Citirea testului FISH
7.3.1. Lamele se examinează imediat cu ajutorul unui
microscop cu epifluorescentă, cu obiectivul de imersie, în ulei de imersie
la o mărire de 630 x 1.000. Cu un filtru sensibil la izotiocianat de
fluoresceină (FITC), celulele eubacteriene prezente în probe (inclusiv
majoritatea celulelor Gram-negative) apar colorate în verde fluorescent. Cu un
filtru adaptat la tetrametil-rodamin-5-izotiocianat, celulele de Ralstonia
solanacearum marcate cu Cy3 apar colorate în rosu fluorescent. Se
compară morfologia celulelor din probe cu cea a celulelor din controlul
pozitiv. Celulele trebuie să fie colorate complet si intens fluorescente.
Testul FISH (pct. 7) trebuie repetat în cazul în care apare o coloratie
anormală. Godeurile se examinează de-a lungul a două diametre
perpendiculare si în jurul perimetrului. Pentru probele care nu contin celule
sau contin un număr mic de celule, se examinează cel putin 40 de
câmpuri microscopice.
7.3.2. Se observă prezenta celulelor intens
fluorescente, cu o morfologie tipică de Ralstonia solanacearum în
ferestrele de test ale lamelor (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensitatea fluorescentei
trebuie să fie echivalentă cu cea a tulpinii de control pozitiv sau
mai bună. Celulele cu coloratie incompletă sau cu fluorescentă
slabă nu trebuie luate în considerare.
7.3.3. La cea mai mică suspiciune de contaminare,
testul trebuie repetat. Aceasta se poate întâmpla atunci când în toate lamele
unei serii de analize se observă celule pozitive din cauza
contaminării tamponului sau atunci când celulele pozitive se observă
în afara godeurilor.
7.3.4. Există un anumit număr de probleme inerente
care afectează specificitatea testului FISH. La nivelul conurilor de tesut
vascular si tulpinii pot apare populatii de celule fluorescente cu morfologie
atipică si populatii de bacterii saprofite care dau reactii încrucisate,
având dimensiuni si morfologii asemănătoare cu celulele de Ralstonia
solanacearum, însă într-o proportie mult mai mică decât în cazul
testului IF.
7.3.5. Se iau în considerare numai celulele fluorescente
cu dimensiune si morfologie tipice.
7.3.6. Interpretarea rezultatului testului FISH:
(i) Testul FISH este valid atunci când celulele intens
fluorescente de culoare verde, cu dimensiuni si morfologie tipice pentru Ralstonia
solanacearum, sunt vizibile cu ajutorul filtrului FITC si celulele intens
fluorescente de culoare rosie sunt vizibile folosindu-se filtrul cu
rodamină în toate controalele pozitive, iar în controlul negativ nu se
observă nicio celulă. În cazul în care proba contine celule intens
fluorescente, cu o morfologie tipică, se estimează numărul mediu
de celule tipice pe câmp microscopic si se calculează numărul de
celule tipice pe ml de sediment resuspendat (apendice 4).
Probele ce contin cel putin 5 x 103 celule
tipice pe ml de sediment resuspendat se consideră ca fiind potential
infectate si se recomandă continuarea testelor. Probele ce contin mai
putin de 5 x 103 celule tipice pe ml de sediment resuspendat sunt
considerate ca fiind negative, (ii) Testul FISH este negativ în cazul în care
celulele intens fluorescente de culoare rosie, având dimensiuni si morfologie
caracteristice pentru Ralstonia solanacearum, nu se observă cu
ajutorul filtrului cu rodamină, cu conditia ca celulele intens
fluorescente de culoare rosie să fie vizibile în lamele de control pozitiv
folosindu-se filtrul cu rodamină.
8. Testele ELISA
Principiu
Testul ELISA nu poate fi utilizat ca test secundar pe
lângă testele IF, PCR sau FISH din cauza sensibilitătii sale relativ
slabe. În cazul aplicării metodei DAS-ELISA, îmbogătirea probelor si
utilizarea anticorpilor monoclonali sunt obligatorii (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). îmbogătirea probelor înainte de
efectuarea testului ELISA poate fi utilă pentru cresterea
sensibilitătii acestuia, dar poate să inhibe testul din cauza
competitiei cu alte organisme prezente în probă.
notă.- Se foloseste o sursă validată de anticorpi de Ralstonia
solanacearum (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Se recomandă să se
determine titrul pentru fiecare lot nou de anticorpi. Titrul se defineste ca
fiind cea mai mare dilutie la care se obtine o reactie optimă atunci când
se testează o suspensie de 105-106 celule pe ml din
tulpina omologă de Ralstonia solanacearum folosindu-se conjugate
corespunzătoare de anticorpi secundari, în conformitate cu
recomandările producătorului. La efectuarea testului, dilutia de
lucru a anticorpilor trebuie să fie aproximativ egală sau egală
cu cea a titrului formulei comerciale.
Se determină titrul anticorpilor pentru o suspensie
de 105-106 celule/ml dintr-o tulpină omologă de
Ralstonia solanacearum.
Drept controale negative se utilizează un extract de
probă care a dat anterior rezultate negative pentru Ralstonia
solanacearum si o suspensie bacteriană preparată în tampon fosfat
care nu provoacă reactii încrucisate
Drept control pozitiv se folosesc extracte de probe care
au dat anterior rezultate negative, la care s-a adăugat 103-104
celule/ml de biovar 2 de Ralstonia solanacearum (de exemplu,
tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vezi apendicii 2 A si B). Pentru a
compara rezultatele din fiecare placă se foloseste o suspensie standard de
105-106 celule/ml în PBS de Ralstonia solanacearum. Controalele
pozitive trebuie să fie μlpetate cu grijă pe placa de
microtitrare, separat de proba sau probele care fac obiectul testului.
Materialele de control pozitiv si negativ standardizate,
disponibile pentru utilizare în acest test, sunt enumerate în apendicele 3 A.
Materialul de control se testează în acelasi mod cu
probele.
Au fost validate două protocoale ELISA:
a) ELISA indirect (Robinsdn-Smith etal., 1995)
(1) Se folosesc alicote de 100-200 μl de sediment
resuspendat. (Pentru a reduce rezultatele nespecifice se încălzesc timp de
4 minute la 100°C pe baie de apă sau într-un bloc de încălzire.)
(2) Se adaugă un volum egal de tampon 2X (apendicele
4) si se omogenizează prin vortexare.
(3) Se μlpetează alicote de 100 μl de
extract în cel putin două godeuri ale plăcii de microtitrare (de
exemplu, Nunc-Polysorp sau echivalent) si
se incubează o oră la 37°C sau peste noapte la 4°C.
(4) Se îndepărtează extractele din godeuri. Se spală
godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (apendicele 4), lăsând ultima solutie de
spălare în godeuri cel putin 5 minute.
(5) Se prepară dilutia corespunzătoare a
antiserului anti-Ralstonia solanacearum în tampon de saturatie
(apendicele 4). Pentru anticorpii comerciali validati, se folosesc dilutiile
recomandate (de obicei, de două ori mai concentrate decât titrul).
(6) Se μlpeteazălOO μl în fiecare godeu si
se incubează o oră la 37°C.
(7) Se îndepărtează solutia de anticorpi din
godeuri si se spală în conformitate cu cele indicate anterior [pct. (4)].
(8) Se prepară dilutia corespunzătoare de
conjugat secundar de anticorpi si de fosfatază alcalină în tampon de
saturatie Se μlpeteazălOO μl în fiecare godeu si se
incubează o oră la 37°C.
(9) Se îndepărtează conjugatul de anticorpi din
godeuri si se spală în conformitate cu cele indicate anterior [pct. (4)].
(10) Se μlpetează 100 μl de solutie de
substrat de fosfatază alcalină (apendicele 4) în fiecare godeu. Se
incubează în întuneric la temperatura ambiantă si se
măsoară absorbanta la 405 nm la intervale regulate în termen de 90 de
minute.
b) DAS-ELISA
(1) Se prepară dilutia corespunzătoare de
imunoglobuline policlonale anti-Ra/ston/a solanacearum în tampon
concentrat cu pH 9,6 (apendicele 4). Se adaugă 200 μl în fiecare
godeu. Se incubează timp de 4-5 ore la 37°C sau timp de 16 ore la 4°C.
(2) Se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween
(apendicele 4). Se adaugă 190 μl de extract de probă în cel
putin două
godeuri. De asemenea, se adaugă controlul pozitiv si
negativ în cât& două godeuri pe fiecare placă. Se incubează
timp de 16 ore la 4°C.
(3) Se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween
(apendicele 4).
(4) Se prepară o dilutie corespunzătoare de
anticorpi monoclonali specifici Ralstonia solanacearum în PBS
(apendicele 4) continând, de asemenea, 0,5 % seralbumină bovină (BSA)
si se μlpetează 190 μl în fiecare godeu. Se incubează
două ore la 37°C.
(5) Se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween
(apendicele 4).
(6) Se prepară o dilutie corespunzătoare de
imunoglobuline antisoarece conjugate cu fosfatază alcalină în PBS. Se
adaugă 190 μl în fiecare godeu. Se incubează două ore la
37°C.
(7) Se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween
(apendicele 4).
(8) Se prepară o solutie de substrat de
fosfatază alcalină continând 1 mg de p-nitrofenil fosfat pe ml de
solutie tampon (apendicele 4). Se adaugă 200 μl în fiecare godeu. Se
incubează la întuneric la temperatura ambiantă si se
măsoară absorbanta la 40 nm la intervale regulate în termen de 90 de
minute.
Interpretarea rezultatelor testelor ELISA
Testul ELISA este negativ atunci când densitatea
optică (DO) medie a godeurilor probei duplicate este mai mică decât
de două ori densitatea optică a godeurilor controlului negativ, cu
conditia ca densitatea optică a controlului pozitiv să fie întotdeauna
mai mare de 1,0 (după 90 de minute de incubare cu substratul) si de
două ori mai mare decât densitatea optică obtinută pentru
controlul negativ.
Testul ELISA este pozitiv atunci când densitatea
optică (DO) medie a godeurilor probei duplicate este mai mare decât de
două ori densitatea optică a godeurilor controlului negativ, cu
conditia ca DO pentru toate godeurile de control negativ să fie mai
mică decât de două ori DO obtinută pentru godeurile de control
pozitiv.
O citire negativă a testului ELISA în godeurile de
control pozitiv indică faptul că testul nu a fost efectuat corect sau
că a fost inhibat O citire pozitivă a testului ELISA în godeurile de
control negativ indică o contaminare încrucisată sau o reactie
nespecifică.
9. Testul biologic
NOTĂ:
Testele preliminare efectuate în conformitate cu această metodă
trebuie să permită o detectie reproductibilă a 103-10*
celule formatoare de colonii (UFC) per ml de Ralstonia solanacearum adăugate
la extractele de probe care au dat anterior rezultate negative (preparare: vezi
apendice 3).
Sensibilitatea cea mai mare de detectie poate fi
atinsă atunci când se folosesc extracte de probe proaspăt preparate
si în conditii optime de crestere. Cu toate acestea, metoda se poate aplica cu
succes extractelor păstrate în glicerol la o temperatură
cuprinsă între - 68 si - 86°C.
Următorul protocol se bazează pe protocolul
Janse (1988):
9.1. Pentru fiecare probă se utilizează 10
plante-test ale unui soi (cultivar) de tomate sensibil (de exemplu, Moneymaker
sau un cultivar cu o sensibilitate echivalentă stabilită în
laboratorul de testare) în stadiul celei de-a treia frunze adevărate.
Pentru detalii privind cultura, vezi apendicele 8. De asemenea, se pot utiliza
vinete (de exemplu, Black Beauty sau cultivări cu o sensibilitate
echivalentă), folosindu-se numai plante în stadiul celei de-a doua sau a
treia frunze până la dezvoltarea completă a celei de-a treia frunze
adevărate. Cu toate acestea, s-a constatat că la plantele de vinete
simptomele sunt mai putin severe si se dezvoltă mai încet. Prin urmare,
atunci când este posibil, se recomandă utilizarea plantulelor de tomate.
9.2. Se inoculează100 μl de extract în fiecare
plantă-test.
9.2.1. Inoculare prin injectare
Plantele-test se inoculează în tulpină chiar
deasupra cotiledoanelor cu ajutorul unei seringi cu ac hipodermic (minimum
23G).
9.2.2. Inoculare prin incizie
Se tine planta între două degete si se
μlpetează pe tulpină, între cotiledoane si prima frunză, o
μlcătură (circa 5-10 μl) de extract de probă.
Cu ajutorul unui bisturiu steril, plecând de la
μlcătura de extract, se face o incizie diagonală pe o lungime de
1 cm si cu o adâncime egală cu aproximativ două treimi din grosimea
tulpinii.
Se închide incizia aplicând vaselină sterilă cu
ajutorul unei seringi.
9.3. Prin aceeasi tehnică se inoculează 5
plantule cu o suspensie apoasă de 105-106 celule per
ml dintr-o cultură virulentă de 48 de ore de Ralstonia
solanacearum biovar 2 drept control pozitiv si 5 plantule cu tampon fosfat
(apendice 4) drept control negativ. Se separă plantele control pozitiv si
negativ de celelalte plante pentru a se evita contaminările încrucisate.
9.4. Plantele test se cresc în încăperi de
carantină până la 4 săptămâni la temperatura de 25-30°C si
umiditate relativ mare, stropindu-le în mod corespunzător pentru a preveni
o suprasaturare hidrică sau ofilirea din lipsă de apă. Pentru a
se evita contaminarea, plantele control pozitiv si negativ se incubează
separat în standuri separate în mod corespunzător într-o seră ori
cameră de cultivare sau, în cazul în care spatiul este limitat, se
asigură o separare strictă între metodele de tratare. Atunci când
plantele apartinând unor probe diferite trebuie incubate în apropiere unele de
celelalte, trebuie prevăzute între ele ecrane de separare
corespunzătoare. În timpul fertilizării, stropirii, controlului sau
oricărei alte manipulări, trebuie luate toate măsurile de
precautie pentru a se evita o contaminare încrucisată. Este esential ca în
serele si camerele de cultivare să nu fie insecte, dat fiind faptul
că acestea ar putea transmite bacteria de la o probă la alta.
Se observă
aparitia simptomelor de ofilire: epinastie, cloroză si/sau
μlpernicire.
9.5. Se izolează plantele infectate si se
identifică culturile purificate prezumtive (suspecte) de Ralstonia solanacearum
(Ut. B). _
9.6. În cazul în care nu se observă niciun simptom
după 3 săptămâni, se efectuează un test IF/PCR/de izolare
pe o probă formată din bucăti de tulpină de 1 cm prelevate
de la fiecare plantă-test chiar deasupra punctului de inoculare. În cazul
în care testul este pozitiv, se efectuează însământarea pe mediu de
cultură (pct. 4.1).
9.7. Se identifică toate culturile purificate
prezumtive de Ralstonia solanacearum (lit. B).
Interpretarea rezultatelor testului biologic:
Rezultatele testului biologic sunt valide atunci când
plantele control pozitiv prezintă simptome tipice, bacteriile pot fi
reizolate din aceste plante si nu se observă niciun simptom la plantele
control negativ.
Testul biologic este negativ în cazul în care
plantele-test inoculate cu extract de probă nu sunt infectate cu Ralstonia
solanacearum si cu conditia ca Ralstonia solanacearum să fie
detectată în plantele control pozitiv.
Testul biologic este pozitiv dacă plantele-test sunt
infectate cu Ralstonia solanacearum.
B. TESTE DE IDENTIFICARE
Culturile pure prezumtive de Ralstonia solanacearum se
identifică prin cel putin unul dintre următoarele teste bazate pe
principii biologice diferite.
Se includ, după caz, tulpini de referintă
cunoscute, pentru fiecare test efectuat (vezi apendicele 3).
1. Teste
de identificare enzimatice si de nutritie
Se stabilesc următoarele caracteristici fenotipice
prezente sau absente sistematic la Ralstonia solanacearum, în
conformitate cu metodele descrise de Lelliott si Stead (1987), Klement et
al. (1990) si Schaad (2001).
|
Test |
Rezultat preconizat |
|
Productia de μlgmenti fluorescenti |
- |
|
Incluziuni de poli-lt-hidroxibutirat |
+ |
|
Test de oxidare/fermentare (O/F) |
O+/F- |
|
Activitatea catalazei |
+ |
|
Testul oxidazei de Kovac |
+ |
|
Reducerea nitratului |
+ |
|
Utilizarea citratului |
+ |
|
Crestere la 40°C |
- |
|
Crestere în 1 % NaCl |
+ |
|
Crestere în 2 % NaCl |
- |
|
Activitatea arginin dihidrolazei |
- |
|
Lichefierea gelatinei |
- |
|
Hidroliza amidonului |
- |
|
Hidroliza esculinei |
- |
|
Productie de levan |
- |
2. Testul IF
2.1. Se prepară o suspensie de circa 106
celule/ml în tampon IF (apendice 4).
2.2. Se prepară o serie de dilutii de 1/2 dintr-un
antiser corespunzător (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
2.3. Se aplică procedura testului IF (lit ApcL 5).
2.4. Pentru ca un test IF să fie pozitiv, titrul
obtinut pentru cultură trebuie să fie echivalent cu cel al
controlului pozitiv.
3. Testul ELISA
notă: În cazul în care se
efectuează numai două teste de identificare, nu se efectuează
alte teste serologice pe lângă această metodă.
3.1. Se prepară o suspensie de circa 108
celule/ml în PBS 1X (vezi apendicele 4).
3.2. Se aplică procedura ELISA corespunzătoare
cu un anticorp monoclonal specific de Ralstonia solanacearum.
3.3. Un test ELISA este pozitiv atunci când densitatea
optică a culturii este egală cel putin cu % din densitatea
optică obtinută pentru controlul pozitiv.
4. Testul reactiei de polimerizare în lant (PCR)
4.1. Se prepară o suspensie de circa 106
celule/ml în apă sterilă ultrapură.
4.2. Se μlpetează 100 ui din suspensie în
tuburi închise si se pun într-un bloc de încălzire sau pe baie de apă
la 100°C timp de 4 minute. Apoi probele pot fi păstrate la o
temperatură situată între - 16 si - 24°C până în momentul în
care sunt utilizate în următoarele etape ale testului PCR.
4.3. Se aplică protocoalele PCR corespunzătoare
pentru amplificarea fragmentelor tipice de Ralstonia solanacearum vezi,
de exemplu, Seal et al. (1993), Pastrik & Maiss (2000), Pastrikef al.
(2002), Boudazin etal. (1999), Opina etal. (1997), Wellerefa/.
(1999).
4.4. O identificare pozitivă a bacteriei Ralstonia
solanacearum seobtine atunci când fragmentele amplificate prin PCR au
aceeasi dimensiune si aceleasi polimorfisme ale dimensiunii fragmentelor de
restrictie cu cele ale tulpinii de control pozitiv.
5. Testul de hibridizare fluorescentă in situ (FISH)
5.1. Se prepară o suspensie de circa 10tcelule/ml în
apă ultrapură.
5.2. Se aplică procedura FISH (lit. A pct. 7)
folosindu-se cel putin două oligosonde specifice pentru Ralstonia
solanaceamm (apendice 7).
5.3. Pentru ca un test FISH să fie pozitiv, cultura
trebuie să prezinte aceleasi reactii ca si controlul pozitiv.
6. Profilul acizilor grasi (FAP)
6.1. Se realizează o
cultură de 48 de ore (28°C) pe mediu tripticaz-soia-agar (Oxoid).
6.2. Se aplică procedura FAP corespunzătoare
(Janse, 1991; Stead, 1992).
6.3. Pentru ca un test FAP să fie pozitiv, profilul
culturii prezumtive trebuie să fie identic cu cel al controlului pozitiv.
Prezenta acizilor grasi caracteristici 14:0 30H, 16:0 20H, 16:1 20H si 18:1 20H
si absenta16:0 30H indică prezenta Ralstonia sp.
7. Metode de caracterizare a tulpinii
Se recomandă o caracterizare a tulpinii prin una
dintre următoarele metode pentru fiecare caz nou de izolare a bacteriei Ralstonia
solanaceamm.
Se includ, după caz, tulpini de referintă
cunoscute pentru fiecare test efectuat (vezi apendicele 3).
7.1. Determinarea biovarului
Există diferite biovaruri de Ralstonia
solanaceamm în functie de capacitatea lor de a utiliza si/sau oxida 3
zaharuri si 3 hexoze alcoolice (Hayward, 1964 si Hayward et al., 1990).
Mediile de crestere pentru testul biovarului sunt descrise în apendicele 2.
Testul poate fi realizat inoculând prin injectare profundă a mediilor cu
culturi pure de izolat de Ralstonia solanaceamm si incubare la 28°C. În
cazul în care mediile sunt repartizate pe plăci de cultură cu 96 de
godeuri sterile (200 ul/godeu), se poate observa o modificare a culorii, în 72
de ore, din verde-oliv în galben, ceea ce indică un rezultat pozitiv al
testului.
|
|
Biovar |
|
|
|
|
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
Utilizarea: |
|
|
|
|
|
|
Maltozei Lactozei D (+) Celobiozei Manitolului Sorbitolului Dulcitolului |
- - - - - - |
+ + - - - |
+ + + + + + |
- - - + + + |
+ + + + - - |
|
Teste suplimentare diferentiază biovarul 2 în
subfenotipuri: |
|
|
|
||
|
|
Biovar 2A (răspândit în lume) |
Biovar 2A (găsit în Chile si în Columbia) |
Biovar 2T (găsit în zona tropicală) |
||
|
Utilizarea trehatozet Utilizarea mezo-inozitei Utilizarea D-ribozei Activitate pectolitică1 |
- + - scăzută |
+ - - scăzută |
+ + + ridicată |
||
|
1) Vezi Lelliott & Stead (1987) |
|||||
7.2. Amprentare genomică
Diferentierea moleculară a tulpinilor din complexul Ralstonia
solanacearum se poate face prin:
7.2.1. analiza polimorfismului dimensiunii fragmentelor
de restrictie (RFLP) (Cook et al., 1989);
7.2.2. PCR realizat pe secvente repetitive folosindu-se
primeri REP, BOX si ERIC (Louws et al, 1995; Smith ef al, 1995);
7.2.3. analiza polimorfismului dimensiunii fragmentelor
de restrictie amplificate (Van der Wolf ef al., 1998).
7.3". metodele PCR.
Se pot folosi primeri specifici PCR (Pastrik et al.,
2002; vezi apendice 6) pentru a diferentia tulpinile apartinând diviziunii 1
(biovari 3,4 si 5) si diviziunii 2 (biovari 1, 2A si 2T) ale Ralstonia
solanacearum, definite initial de analiza RFLP (Cook ef al., 1989)
si analiza secventei 16S a ADNr (Taghavi et al., 1996).
C. TEST DE CONFIRMARE
Testul de patogenitate trebuie efectuat pentru
confirmarea finală a diagnosticului si pentru evaluarea virulentei
culturilor identificate ca fiind Ralstonia solanacearum.
(1) Se prepară un inoculum de circa 106
celule/ml dintr-o cultură de 24-48 de ore dintr-o tulpină
corespunzătoare de control pozitiv de Ralstonia solanacearum (de
exemplu, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vezi apendicele 3).
(2) Se inoculează 5-10 plantule de tomate sau vinete
sensibile, în stadiul celei de a treia frunze adevărate (vezi lit. A pct.
9).
(3) Se incubează până la două
săptămâni la 25-28°C si umiditate relativă crescută,
asigurând o stropire corespunzătoare pentru a preveni suprasaturarea
hidrică sau stresul de deshidratare. În cazul culturilor pure, în 15 zile
ar trebui să intervină ofilirea. În absenta simptomelor la-sfârsitul
acestei perioade, cultura nu poate fi confirmată ca fiind o formă
patogenă de Ralstonia solanacearum.
(4) Se observă aparitia simptomelor de ofilire
si/sau epinastie, cloroză si de μlpernicire.
(5) Se izolează plantele simptomatice
îndepărtând o sectiune de tesut din tulpină la 2 cm deasupra
punctului de inoculare. Se mărunteste si se suspendă într-un volum
mic de apă distilată sterilă sau tampon fosfat de 50 mM
(apendice 4). Se însământează suspensia pe un mediu adecvat, de
preferintă mediu selectiv (apendice 2), se incubează timp de 48-72 de
ore la 28°C si se observă formarea coloniilor tipice de Ralstonia
solanacearum.
Apendicele 1
|
Laborator1) |
Oras |
Tara |
|
|
Agentur fur Gesundheit und Emahrungssicherheit |
Viena si Linz |
Austria |
|
|
Departament Gewasbescherming |
Merelbeke |
Belgia |
|
|
Plantedirektoratet |
Lyngby |
Danemarca |
|
|
Central Science Laboratory |
York |
Anglia |
|
|
Scottish Agricultural Science Agency |
Edinburgh |
Scotia |
|
|
Laboratoire national de la protection des vegetaux, |
Angers |
Franta |
|
|
Unite de Bacteriologie |
|
|
|
|
Laboratoire national de la protection des vegetaux, |
Le Rheu |
Franta |
|
|
Station de quarantine de la pomme de terre |
|
|
|
|
Biologische Bundesanstalt |
Kleinmachnow |
Germania |
|
|
Pflanzenschutzamt Hannover |
Hanovra |
Germania |
|
|
State Laboratory |
Dublin |
Irlanda |
|
|
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali |
Bologna |
Italia |
|
|
Regione Veneto Unita Periferica per i Servizi
Fitosanitari |
Verona |
Italia |
|
|
Nederlandse Algemene Keuringesdienst Plantenziektenkundige Dienst Direccao-Geral de Proteccao das Culturas Centro de Diagnostico de Aldearrubia Institute Valenciano de Investigaciones Agrarias Swedish University of Agricultural Sciences |
Emmeloord Wageningen Lisabona Salamanca Valencia Uppsala |
Tările de Jos Tările de Jos Portugalia Spania Spania Suedia |
|
1)
Experti de contact: vezi http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main .
Apendicele 2
Medii pentru izolarea si cultivarea bacteriei Ralstonia
solanacearum
a) Medii de crestere în general
Agar nutritiv (AN)
Agar nutritiv (Difco) 23,0 g
Apă distilată 1,0 I
Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin
autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
Drojdie - peptonă - glucoză-agar (YPGA)
Extract de levură (Difco) 5,0 g
Bacto-peptonă (Difco) 5,0 g
D (+) glucoza (monohidrat) 10,0 g
Bacto-agar (Difco) 15,0 g
Apă distilată 1,01
Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin
autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
Zaharoză - peptonă - agar (SPA)
Zaharoză 20,0 g
Bacto-peptonă (Difco) 5,0 g
K2HPO4 0,5 g
MgSO4·7H2O 0,25 g
Bacto-geloză (Difco) 15,0 g
Apă distilată 1,0 I
pH 7,2-7,4
Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin
autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
Mediul tetrazoliu Kelman
Acizi casiminici (Difco) 1,0 g
Bacto-peptonă (Difco) 10,0 g
Dextroză 5,0 g
Bacto-agar (Difco) 15,0 g
Apă distilată 1,01
Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin
autoclavare la 121 °C timp de 15 minute.
Se răceste la 50°C si se adaugă o solutie
apoasă sterilizată prin filtrare de clorură de
2,3,5-trifeniltetrazoliu (Sigma) pentru obtinerea unei concentratii finale de
50 mg la litru.
b) Medii de crestere selective validate
Mediu SMSA
(Englebrecht, 1994, modificat de Elphinstone ef al., 1996) Mediu de
bază
Acizi casiminici (Difco) 1,0 g
Bacto-peptonă (Difco) 10,0 g
Glicerol 5,0 ml
Bacto-agar (Difco) (vezi nota 2) 15,0 g
Apă distilată 1,01
Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin
autoclavare la 121 °C timp de 15 minute.
Se răceste la 50°C si se adaugă solutii apoase
concentrate, sterilizate prin filtrare, continând următoarele ingrediente
pentru obtinerea concentratiilor finale specificate:
Cristal violet (Sigma) 5 mg la litru
Sulfat de polimixină B (Sigma P-1004) 600.000
unităti (circa 100 mg) la litru
Bacitracină (Sigma B-0125) Cloramfenicol (Sigma
C-3175) Penicilină-G (Sigma P-3032) Clorură de
2,3,5-trifeniltetrazoliu (Sigma)
Observatii:
1. Utilizarea altor reactivi decât cei mentionati
anterior poate afecta cresterea bacteriei Ralstonia solanacearum.
2. Agarul
de tip oxoid nr. 1 poate fi înlocuit de Bacto-agar (Difco). În acest caz,
cresterea bacteriei Ralstonia solanacearum va fi mai lentă, dar si
cresterea bacteriilor saprofite concurente ar putea fi, de asemenea,
redusă. Dezvoltarea coloniilor tipice de Ralstonia solanaceamm poate
dura o zi sau două în plus, iar coloratia rosie poate fi mai putin
pronuntată decât pe mediu de Bacto-agar.
3. O crestere a concentratiei de bacitracină la
2.500 de unităti la litru poate reduce populatiile de bacterii concurente
fără a perturba cresterea bacteriei Ralstonia solanacearum.
Mediile si solutiile concentrate de antibiotice se
păstrează la 4°C la întuneric si timp de maximum o lună.
Trebuie asigurată absenta condensului pe suprafata
plăcilor înainte de utilizare.
A se evita uscarea excesivă a plăcilor.
După prepararea fiecărui lot nou de mediu de
cultură trebuie efectuat un control de calitate prin însământarea
unei suspensii
1.250 unităti (circa 25 mg) la litru 5 mg la litru
825 unităti (circa 0,5 mg) la litru 50 mg la litru
dintr-o cultură de referintă de Ralstonia
solanacearum (vezi apendicele 3) si se observă formarea de colonii
tipice după incubarea la 28°C timp de 2-5 zile.
c) Medii de îmbogătire validate
Mediu nutritiv SMSA (Elphinstone et al., 1996)
Se prepară ca si pentru mediul selectiv SMSA, dar se
elimină Bacto-agar si clorura de 2-3-5-tetrazoliu.
Mediu nutritiv modificat Wilbrink (Caruso et al., 2002)
Zaharoză 10 g
Proteoză peptonă 5 g
K2HPO4 0,5 g
MgS04 0,25 g
NaN03 0,25 g
Apă distilată 1 I
Se sterilizează prin autoclavare la 121 °C timp de
15 minute si se răceste la 50°C.
Se adaugă solutii concentrate de antibiotice ca si
pentru mediul nutritiv SMSA.
Apendicele 3 A.
a) Tulpini bacteriene
Următoarele tulpini bacteriene se recomandă
spre utilizare în calitate de material standard de referintă sau control
pozitiv (tabelul 1) sau pe parcursul optimizării testelor pentru a evita
reactiile încrucisate (tabelul 2). Toate tulpinile sunt disponibile în comert
la următoarele adrese:
1. National Collection of Plant Pathogenic Bacteria
(NCPPB), Central Science Laboratory, York, UK;
2. Culture Collection of the Plant Protection Service
(PD), Wageningen, Tările de Jos;
3. Collection francaise de bacteries phytopathogenes
(CFBP), INRA- Station de phytobacteriologie, Angers, Franta. Tabelul 1. Tulpini
de referintă SMT de Ralstonia solanacearum
|
Cod NCPPB |
SMT# |
Alte coduri |
Tara de origine |
Biovar |
|
NCPPB 4153 |
6 |
CFBP 4582, Pr3020, EURS 11 |
Egipt |
2 |
|
NCPPB 4154 |
10 |
CFBP 4585, 550, EURS 21 |
Turcia |
2 |
|
NCPPB 3857 |
12 |
CFBP 4587, Pr 1140, EURS 26 |
Anglia |
2 |
|
NCPPB1584 |
23 |
CFBP 4598, EURS 49 |
Cipru |
2 |
|
NCPPB 2505 |
24 |
CFBP 4599, EURS 50 |
Suedia |
2 |
|
NCPPB 4155 |
26 |
CFBP 4601,502, EURS 55 |
Belgia |
2 |
|
NCPPB 4156(*) |
71 O |
PD 2762, CFBP 3857 |
Tările de Jos |
2 |
|
NCPPB 4157 |
66 |
LNPV 15,59 |
Franta |
2 |
|
NCPPB 4158 |
39 |
CFBP 4608, Port448, EURS 80, NCPPB 4066 |
Portugalia |
2 |
|
NCPPB 4160 |
69 |
IVIA-1632-2 |
Spania |
2 |
|
NCPPB 4161 |
76 |
B3B |
Germania |
2 |
|
NCPPB 325 |
41 |
CFBP 2047, KEL 60-1, R 842 |
Statele Unite |
1 |
|
NCPPB 3967 |
42 |
CFBP 4610, R285, GONg7 |
Costa Rica |
1 |
|
NCPPB 4028 |
43 |
CFBP 4611, R303/571, CIP 310, SEQ 205 |
Columbia |
2 |
|
NCPPB 3985 |
44 |
CFBP 4612, R 578, CIP 312 |
Peru |
2T |
|
NCPPB 3989 |
45 |
CFBP 4613, R 568, CIP 226 |
Brazilia |
2T |
|
NCPPB 3996 |
46 |
CFBP 3928, R 276/355, CIP 72, SEQ 225 |
Peru |
3 |
|
NCPPB 3997 |
47 |
CFBP 4614, R 280/363, CIP 49, HAY 0131a |
Australia |
3 |
|
NCPPB 4029 |
48 |
CFBP 4615, R 297/ 349, CIP 121, CMIb 2861 |
Sri Lanka |
4 |
|
NCPPB 4005 |
49 |
CFBP 4616, R470 |
Filipine |
4 |
|
NCPPB 4011 |
50 |
CFBP 4617, R288, Hemps 2 |
China |
5 |
*)A
se utiliza ca tulpină de referintă standard biovarul 2 rasa 3 de Ralstonia
solanacearum.
notă: Autenticitatea tulpinilor mentionate anterior poate fi
garantată numai în cazul în care acestea sunt obtinute dintr-o colectie de
culturi atrtentice.
Tabelul 2. Tulpini de referintă SMT corelate
serologic sau genetic în vederea utilizării pentru optimizarea testelor de
detectie
|
Cod NCPPB |
SMT# |
Alt cod |
Identificare |
|
NCPPB4162 |
51 |
CFBP 1954 |
Bacillus polymyxa 1) |
|
NCPPB 4163 |
52 |
CFBP1538 |
Pseudomonas marginalis pv. Marginalis 1) |
|
NCPPB 4164 |
- |
CFBP 2227 |
Burkholderia cepacia2) |
|
NCPPB 4165 |
- |
CFBP 2459 |
Ralstonia μlckettii2) |
|
NCPPB 4166 |
58 |
CFBP 3567 CSLPM150 |
Ralstonia μlckettii1) |
|
NCPPB 4167 |
60 |
CFBP 4618 PD 2778 |
Ralstonia sp 1) |
|
NCPPB 1127 |
53 |
CFBP3575 |
Burkholderia andropogonis 1) |
|
NCPPB 353 |
54 |
CFBP 3572 |
Burkholderia caryophylli1) |
|
NCPPB 945 |
55 |
CFBP 3569 |
Burkholderia cepacia 1) |
|
NCPPB 3708 |
56 |
CFBP 3574 |
Burkholderia glumae 1) |
|
NCPPB 3590 |
57 |
CFBP 3573 |
Burkholderia plantarii1) |
|
NCPPB 3726 |
59 |
CFBP 3568 |
Banana Blood Disease Bacterium 1),2),3) |
|
NCPPB 4168 |
61 |
CFBP 4619 IPO S339 |
Enterobacter sp 1) |
|
NCPPB 4169 |
62 |
IPO 1695 |
Enterobacter sp 1) |
|
NCPPB4170 |
63 |
CFBP 4621 IPO S306 |
Ochrobactrum anthropi 1), 2) |
|
NCPPB 4171 |
64 |
CFBP 4622 IPO 1693 |
Curtobacterium sp 1),2) |
|
NCPPB 4172 |
65 |
IPO 1696a |
Pseudomonas sp 1) |
|
NCPPB 4173 |
|
PD2318 |
Aureobacteriu sp2) |
|
NCPPB 4174 |
81 |
IVI A 1844.06 |
Flavobacterium sp1)-2) |
1)
Tulpină care poate determina în testele serologice (IF si/sau ELISA) o
reactie încrucisată cu antiserurile policlonale.
2)
Tulpină din care poate fi amplificat produsul PCR în anumite laboratoare,
având dimensiuni asemănătoare celor preconizate la utilizarea
primerilor specifici OLI-1 si Y-2 (vezi apendicele 6).
3) Poate determina o reactie încrucisată
în majoritatea testelor, dar cunoscut ca fiind prezent numai pe banan în
Indonezia.
b) Material de control standardizat disponibil în
comert Următorul material de control standardizat este disponibil în
colectia de culturi NCPPB:
- granule liofilizate de extract din 200 tuberculi de
cartof sănătosi în calitate de control negativ pentru ansamblul
testelor;
- granule liofilizate de extract din 200 tuberculi de
cartofi sănătosi continând 10M04 si 104-106
celule de biovar 2 de Ralstonia solanacearum (de exemplu, tulpina NCPPB
4156 = PD 2762 = CFBP 3857) în calitate de control pozitiv pentru testele
serologice sl testul PCR. Întrucât liofilizarea afectează viabilitatea
celulelor, acestea nu pot fi folosite drept control standard pentru testele de
izolare sau testele biologice;
- suspensii fixate cu formalină de Ralstonia solanacearum
biovar 2 (tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) de concentratie 106
celule/ml în calitate de control pozitiv pentru testele serologice.
B.
Pregătirea controalelor pozitive si negative pentru testele rapide de
detectie PCR/ F si FISH efectuate pe conuri de cartof
Se realizează o cultură de 48 de ore dintr-o
tulpină virulentă de Ralstonia solanacearum biovar 2 rasa 3
(de exemplu, tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) pe mediu general SMSAsi
se face o suspensie în tampon fosfat 10 mM pentru a obtine o densitate
celulară de circa 2 x 108 ufc/ml. În general, aceasta se obtine
printr-o suspensie usor tulbure echivalentă cu o densitate optică de
0,15-600 nm.
Se extrag conurile de la 200 de tuberculi de cartof,
varietate cu coaja albă cunoscută ca fiind neinfectată cu Ralstonia
solanacearum.
Conurile se tratează după metoda obisnuită
si se resuspendă sedimentul în 10 ml.
Se pregătesc 10 microfiole sterile de 1,5 ml cu 900
ui de sediment resuspendat.
Se transferă 100 ui din suspensia de Ralstonia solanacearum
în prima microfiolă si se omogenizează prin vortexare.
Se realizează dilutii zecimale în următoarele 5
microfiole.
Cele 6 microfiole contaminate vor fi utilizate drept
control pozitiv. Cele 4 microfiole necontaminate se vor folosi în calitate de
control negativ. Se etichetează microfiolele în mod corespunzător.
Se prepară alicote de 100 μl în microfiole
sterile de 1,5 ml pentru a obtine 9 replici din fiecare control. Se
conservă la -16 si - 24°C până la utilizare.
Prezenta si concentratia de celule de Ralstonia
solanacearum în control trebuie confirmate în primul rând prin IF.
Pentru testul PCR, se efectuează o extractie de ADN
din controale pozitive si negative pentru fiecare serie de probe de testare.
Pentru testele IF si FISH, se efectuează teste
asupra controalelor pozitive si negative pentru fiecare serie de probe de
testare.
Pentru testele IF si FISH, nivelul de detectie al
celulelor de Ralstonia solanacearum trebuie să fie de cel putin 106
si 104 celule/ml în controlul pozitiv, iar în controlul negativ
să nu fie detectate.
Apendicele 4
Tampoane pentru procedura de testare
Generalităti: tampoanele sterilizate nedeschise pot
fi păstrate până la un an.
1. Solutii-tampon pentru procedura de extractie
1.1. Tampon de extractie (50 mM tampon fosfat, pH 7,0)
Acest tampon este utilizat pentru extractia bacteriei din
tesuturile plantei prin omogenizare sau agitare. Na2HPO4 4,26 g
KH2PO4 2,72 g
Apă distilată 1, 00 I
Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul si
se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute. Utilizarea
următorilor compusi suplimentari poate fi utilă:
|
|
Utilizare |
Cantitate (la I) |
|
Fulgi de Lubrol |
Peptizant (*) |
0,5 g |
|
Silicon
antispumant DC |
Agent antispumant (*)
|
1,0 ml |
|
Pirofosfat
tetrasodic |
Antioxidant |
1,0 g |
|
Polivinilpirolidonă-40000
(PVP-40) |
Legarea
inhibitorilor PCR |
50 g |
(*)
A se utiliza cu metoda de extractie prin omogenizare.
1.2. Tampon de extract concentrat (10 mM tampon fosfat,
pH 7,2)
Acest tampon este utilizat pentru resuspendarea si
dilutia extractelor de conuri de tuberculi de cartof ca urmare a
concentrării prin centrifugare.
Na2HPO4-12H20 2,7 g
NaH2PO4-2H20 0,4 g
Apă distilată 1,01
Se dizolvă ingredientele si se verifică pH-ul.
Se sterilizează prin autoclavare la 121 °C timp de 15 minute.
2. Solutii-tampon pentru testul de
imunofluorescentă
2.1. Tampon IF: 10 mM PBS, pH 7,2
Acest tampon este utilizat pentru dilutia anticorpilor.
Na2HPO4·12H20 2,7 g
NaH2PO4·2H20 0,4 g
NaCI 8,0 g
Apă distilată 1,01
Se dizolvă ingredientele si se verifică pH-ul.
Se sterilizează prin autoclavare la 121 °C timp de 15 minute.
2.2. Tampon IF-Tween
Acest tampon este utilizat pentru spălarea lamelor.
Se adaugă 0,1 % Tween 20 la tamponul IF.
2.3. Tampon glicerol fosfat, pH 7,6
Acest tampon este utilizat pentru montarea lamei IF pentru
mărirea fluorescentei.
Na2HPO4·12H20 3,2 g
NaH2PO4·2H20 0,15 g
Glicerol 50 ml
Apă distilată 100 ml
în comert sunt disponibile solutii-suport antidecolorare,
de exemplu, Vectashield® (Vector Laboratories) sau Citifluor® (Leica).
3. Solutii tampon pentru testul ELISA indirect
3.1. Tampon de acoperire dublu concentrat, pH 9,6
Na2CO3 6,36 g
NaHCO? 11,72 g
Apă distilată 1,00 I
Se dizolvă ingredientele si se verifică pH-ul.
Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
Poate fi adăugat sulfit de sodiu (0,2 %) ca
antioxidant pentru a împiedica constituirea de compusi aromatici oxidati.
3.2. 10 x tampon de fosfat salin (PBS), pH 7,4
NaCI 80,0 g
KH2PO4 2,0 g
Na2HPO4·12H20 29,0 g
KCl 2,0 g
Apă distilată 1,01
3.3. PBS-Tween
10 x PBS 100 ml
10% Tween 20 5 ml
Apă distilată 895 ml
3.4. Tampon de blocare (anticorpi) (trebuie preparat
proaspăt)
10 x PBS 10,0 ml
Polivinilpirolidonă-44000 (PVP-44) 2,0 g
10%Tween20 0,5 ml
Lapte praf 0,5 g
Apă distilată până la 100 ml
3.5. Solutie de substrat de fosfatază alcalină,
pH 9,8 Dietanolamină 97 ml
Apă distilată 800 ml
Se amestecă si se ajustează la pH 9,8 cu acid
clomidric (HCI) concentrat.
Se adaugă apă distilată până la 1
litru.
Se adaugă 0,2 g MgCI.
Se dizolvă două tablete de 5 mg de substrat de
fosfatază (Sigma) la 15 ml de solutie.
4. Tampoane pentru testul DASI ELISA
4.1. Tampon de acoperire dublu concentrat, pH 9,6
|
Na2CO3 |
|
1,59 g |
|
NaHCO3 |
|
2,93 g |
|
Apă distilată |
|
1.000 ml |
|
Se dizolvă ingredientele si se verifică
pH-ul. |
|
|
|
4.2. 10 x tampon de fosfat salin (PBS), pH 7,2-7,4 |
|
|
|
NaCI |
|
80,0 g |
|
NaH2PO4-2H20 |
|
4,0 g |
|
Na2HPO4-12H20 |
|
27,0 g |
|
Apă distilată |
|
1.000 ml |
|
4.3. PBS-Tween |
|
|
|
10 x PBS |
|
50 ml |
|
10%Tween20 |
|
5 ml |
|
Apă distilată |
|
950 ml |
|
4.4. Tampon de substrat, pK 9,8 |
|
|
|
Dietanolamină |
|
100 ml |
|
Apă distilată |
|
900 ml |
Se amestecă si se ajustează la pH 9,8 cu acid
clomidric (HCI) concentrat.
Apendicele 5
Stabilirea gradului de contaminare în testele IF si FISH
1. Se calculează numărul
mediu de celule fluorescente tipice pe câmp (c).
2. Se calculează numărul de celule fluorescente
tipice pe godeul lamei de microscop (C).
C = c x S/s, unde: S = suprafata (S) a godeului lamei cu
multe godeuri, si
s = suprafata (s) câmpului obiectivului
s = Tri2/4G2K2, unde: i
= coeficientul de câmp (depinde de tipul ocularului si variază de la 8 la
24)
K = coeficientul tubului (1 sau 1,25) G = grosisment (de
100 de ori, 40 de ori etc.) obiectiv.
3. Se calculează numărul de celule fluorescente
tipice pe ml de sediment resuspendat (N). N = Cx1.000/yxF,
unde: y = volumul de extract concentrat resuspendat per
godeu,
si F = factorul de dilutie al sedimentului resuspendat
Apendicele 6
Protocoale PCR si reactivi validati
notă: Testele preliminare trebuie să permită detectia
reproductibilă a 103-104 celule de Ralstonia
solanacearum pe ml de extract de probă
De asemenea,
testele preliminare nu trebuie să indice rezultate fals pozitive cu o
gamă de tulpini bacteriene selectionate (vezi apendicele 3).
1. Protocolul PCR Seal et al. (1993)
1.1. Secventa de oligonucleotide a primerilor
Primer sensOLI-1 5-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3
Primer antisens Y-2 5-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3
Dimensiunea prevăzută a ampliconului de
ADN-tintă de Ralstonia solanacearum = 288 bp
1.2. Amestecul reactiv pentru PCR
|
Reactiv |
Cantitate per reactie |
Concentratie finală |
|
Apă
ultrapură sterilă |
17,65 μl |
|
|
Tampon PCR x 101 (15 mM MgCl2) Amestec dNTP (20 mM) Primer OLI-1 (20 pM) Primer Y-2 (20 mM) Polimerază
Taq (5 U/m1) 1 |
2,5 Ml 0,25 Ml 1,25 Ml 1,25 Ml 0,1 Ml |
1x(1,5mMMgCI2) 0,2 mM 1 μM 1 μM 0,5 U |
|
Volumul de ADN extras din probă |
2,0 Ml |
|
|
Volum total |
25 Ml |
|
1
Metoda a fost validată cu Taq polimerază de PerkinElmer (AmpliTaq) si
Gibco BRL.
1.3. Conditiile reactiei PCR Se urmează procedura:
1 ciclu de: (i) 2 minute la 96°C: denaturarea matritei
ADN
35 cicluri de: (ii) 20 secunde la 94°C: denaturarea
matritei ADN
(iii) 20 secunde la 68°C: hibridizare cu primeri
(iv) 30 secunde la 72°C: extinderea ADN
1 ciclu de: (v) 10 minute la 72°C
(extinderea finală)
(vi) Se mentine la 4°C.
notă: Acest program a fost optimizat pentru termociclorul
PerkinElmer 9600. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor
(ii), (iii) si (iv) pentru o utilizare cu alte modele de termociclor.
1.4. Analiza restrictiei enzimatice a ampliconului
Fragmentele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate
prin PCR produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de
restrictie după incubare la 37°C cu enzima Ava II.
2. Protocolul
PCR Pastrik & Maiss (2000)
2.1. Secventa de oligonucleotide a primerilor
Primer sensPs-1 5-AGT CGA ACG GCA GCG GGG G-3
Primer antisens Ps-2 5-GGG GAT TTC ACA TCG GTC TTG CA-3
Dimensiunea prevăzută a ampliconului
ADN-ului-tintă de Ralstonia solanacearum = 553 bp.
2.2. Amestecul reactiv pentru PCR
|
Reactiv |
Cantitate per reactie |
Concentratie finală |
|
Apă ultrapură sterilă |
16,025 μl |
|
|
Tampon PCR x101 |
2,5 μl |
1x(1,5mMMgCI2) |
|
BSA (fractiune V) (10%) |
0,25 Ml |
0,1 % |
|
Amestec dNTP (20 mM) |
0,125 Ml |
0,1 mM |
|
Primer Ps-1 (10 pM) |
0,5 Ml |
0,2 pM |
|
Primer Ps-2 (10 mM) |
0,5 Ml |
0,2 mM |
|
Polimerază Taq (5 U/pl)1 |
0,1 Ml |
0,5 U |
|
Volumul de ADN extras din probă |
5,0 Ml |
|
|
Volum total |
25,0 Ml |
|
1
Metodele au fost validate cu Taq polimerază de PerkinElmer (AmpliTaq) si
Gibco BRL.
notă: Optimizată initial pentru termociclorul MJ Research
PTC 200 cu polimerază Taq Gibco.
AmpliTaq de PerkinElmer si tamponul pot fi utilizate, de asemenea, la aceleasi concentratii.
2.3. Conditiile reactiei PCR
|
Se urmează procedura: |
- |
|
1 ciclu de: (i) |
5 minute la 95°C: denaturarea matritei ADN |
|
35 cicluri de: (ii) |
30 secunde la 95°C: denaturarea matritei ADN |
|
(iii) |
30 secunde la 68°C: hibridizare cu primeri |
|
(iv) |
45 secunde la 72°C: extinderea ADN |
|
1 ciclu de: (v) |
5 minute la 72°C (extinderea finală) |
|
(vi) |
Se mentine la 4°C. |
notă: - Acest program a fost optimizat pentru termociclorul MJ
Research PTC 200.
Poate fi necesară o modificare a duratei
ciclurilor (ii) (iii) si
(iv) pentru o utilizare cu alte modele de termociclor.
2.4. Analiza restrictiei enzimatice a ampliconului
Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate
prin PCR produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentele de
restrictie după incubare la 65°C cu enzima Taq I
timp de 30 de minute.
Fragmentele de restrictie obtinute din fragmentul specif de ADN de Ralstonia
solanacearum au o lungime de 457 bp si de 96 bp.
3. Protocolul
multiplex PCR si cu control intern al PCR (Pastrik era/., 2002)
3.1. Secventa de primer de oligonucleotide
Primer sens Rs-1-F 5’-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3
Primer antisens Rs-t-R 5 -CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3
Primer sens Ns-5-F 5’-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3
Primer antisens Ns-6-R 5’-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC
CTC-3
Dimensiunea prevăzută a ampliconului
ADN-tintă de Ralstonia solanacearum = 718 bp (în prezenta setului
de primeri Rs) Dimensiunea prevăzută a ampliconului controlului
intern al PCR de 18S ARNr = 310 bp (în prezenta setului de primeri Ns)
3.2. Amestecul reactiv pentru PCR
|
Reactiv |
Cantitate per reactie |
Concentratie finală |
|
Apă ultrapură sterilă |
12,625 μl |
|
|
Tampon PCR x 101 (1,5 mM MgCl) |
2,5 μl 1 x(1,5 mM MgCI2) |
|
|
BSA (fractiune V) (10 %) |
0,25 μl 0,1 % |
|
|
Amestec dNTP (20 mM) |
0,125 μl 0,1 mM |
|
|
Primer Rs-1-F (10 pM) |
2,0 μl 0,8 pM |
|
|
Primer Rs-1-R (10 pM) |
2,0 μl 0,8 pM |
|
|
Primer Ns-5-F (10 pM)2 |
0,15 μl 0,06 pM |
|
|
Primer Ns-6-R (10 pM)2 |
0,15 μl 0,06 pM |
|
|
PolimerazăTaq(5U/pl)1 |
0,2 μl |
1,0 U |
|
Volumul de ADN extras din probă |
5,0 μl |
|
|
Volum total 25,0 μl |
|
|
1
Metodele au fost validate cu polimerază Taq de PerkinElmer (AmpliTaq) si
Gibco BRL.
2
Concentratiile primerilor Ns-5-F si Ns-6-R au fost optimizate pentru extractia
conurilor de cartof, utilizându-se metoda de omogenizare si pentru metoda de
izolare a ADN Pastrik (2000) (vezi sectiunea VI. A.6.1 .a). Va fi nevoie de o nouă optimizare a
concentratiilor de reactivi în cazul în care se aplică extractia prin
agitare si se folosesc alte metode de izolare de ADN.
3.3. Conditiile reactiei PCR Se urmează procedura:
1 ciclu de:
(i) 5 minute la 95°C: denaturarea matritei ADN
35 cicluri de:
(ii) 30 secunde la 95°C: denaturarea matritei ADN
(iii) 30 secunde la 58°C: hibridizare cu primeri
(iv) 45 secunde la 72°C: extinderea ADN
1 ciclu de: (v) 5 minute la 72°C (extinderea finală)
(vi) Se mentine la 4°C.
notă: Acest program a fost optimizat pentru termociclorul MJ
Research PTC 200. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor
(ii), (iii) si (iv) pentru utilizarea cu alte modele de termociclor.
3.4. Analiza restrictiei enzimatice a ampliconului
Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate
prin PCR produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de
restrictie după incubare la 65°C cu enzima Bsm I
sau cu o enzimă
izoschizomeră (de exemplu, Mva 1269 I) timp de 30 de minute.
4. Protocolul PCR biovar specific de Ralstonia
solanacearum (Pastrik era/., 2001)
4.1. Secventa de oligonucleotide a primerilor
Primer sensRs-1 -F 5-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3
Primer antisens Rs-1 -R 5-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3
Primer antisens Rs-3-R 5 -TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3
Dimensiunea prevăzută a ampliconului
ADN-tintă de Ralstonia solanacearum: cuRs-1-F/Rs-1-R = 718bp cu
Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp.
4.2. Amestecul reactiv pentru PCR a) PCR specific
biovarului ˝
|
Reactiv |
Cantitate per reactie |
Concentratie finală |
|
Apă ultrapură sterilă |
12,925 μl |
|
|
Tampon PCR x101 |
2,5 μl |
1 x(1,5mMMgCl2) |
|
BSA (fractiune V) (10%) |
0,25 μl |
0,1 % |
|
Amestec dNTP (20 mM) |
0,125 μl |
0,1 mM |
|
Primer Rs-1-F (10 pM) |
2 μl |
0,8 μM |
|
Primer Rs-1-R (10 mM)
|
2 μl |
0,8 μM |
|
Polimerază Taq (5 U/pl)1 |
0,2 ul |
1 U |
|
Volumul de ADN extras din probă |
5,0 μl |
|
|
Volum total |
25,0 μl |
|
1
Metodele au fost validate cu polimerază Taq PerkinElmer (AmpliTaq) si
Gibco BRL. b) PCR specific
biovarului 3/4/5
|
Reactiv |
Cantitate per reactie |
Concentratie finală |
|
Apă ultrapură sterilă |
14,925 μl |
|
|
Tampon PCRx 101 BSA(fractiuneV)(10%) Amestec dNTP (20 mM) Primer Rs-1-F (10 uM) Primer Rs-3-R (10 uM) Polimerază Taq (5 U/ul)1 |
2,5 Ml 0,25 Ml 0,125 μl 1 μl 1 μl 0,2 μl |
1x(1,5mMMgCl2) 0,1% 0,1 mM 0,4 μM 0,4 μM 1 U |
|
Volumul de ADN extras din probă |
5,0 μl |
|
|
Volum total |
25,0 μl |
|
1
Metodele au fost validate cu polimerază Taq PerkinElmer (AmpliTaq) si
Gibco BRL.
4.3. Conditiile reactiei PCR
Se urmează procedura descrisă în continuare
pentru reactiile specifice biovarului 1/2 si biovarului 3/4/51
1 ciclu de: (i) 5 minute la 95°C: denaturarea matritei
ADN
35 cicluri de: (ii) 30 secunde la 95°C: denaturarea
matritei ADN
(iii) 30 secunde la 58°C: hibridizare cu primeri
(iv) 45 secunde la 72°C: extinderea ADN
1 ciclu de: (v) 5 minute la 72°C (extinderea finală)
(vi) Se mentine la 4°C.
notă: Acest program a fost optimizat pentru termociclorul MJ
Research PTC 200. Poate fi necesară o mbdificare a duratei ciclurilor
(ii), (iii) si (iv) pentru utilizarea cu alte modele de termociclor.
4.4. Analiza restrictiei enzimatice a amplimerului
Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR
utilizând primerii Rs-1-F si Rs-1-R produc un polimorfism distinct al
dimensiunii fragmentelor de restrictie după incubare la 65CC cu
enzima Bsm I sau
cu o enzima izoschizomeră (de exemplu, Mva 1269 I)
timp de 30 de minute.
Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR
utilizând primerii Rs-1-F si Rs-3-R nu au puncte de restrictie.
5. Prepararea tamponului de încărcare
5.1. Albastru de bromfenol (solutie concentrată de
10%)
Albastru de bromfenol 5 g
Apă distilată (bidistilată) 50 ml
5.2. Tampon de încărcare
Glicerol (86%) 3,5 ml
Albastru de bromfenol (5.1) 300 μl
Apă distilată (bidistilată) 6,2 ml
6. Tampon tris-acetat EDTA (TAE) 10 x, pH 8,0
Tampon TRIS 48,40 g
Acid acetic glacial 11,42 ml
EDTA (sare disodică) 3,72 g
Apă distilată 1,00 I
înainte de utilizare se diluează până la 1 x.
De asemenea, acest tampon este disponibil în comert (de exemplu, Invitrogen sau
echivalent).
Apendicele 7
Reactivi validati pentru testul FISH
1. Oligosonde
Sondă OLI-1-CY3 specifică Ralstonia
solanacearum: 5-GGC AGG TAG CAA GCT ACC CCC-3
Sondă eubacteriană EUB-338-FITC
nespecifică: 5-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3
2. Solutia de fixare
Atentie! Solutia de fixare contine paraformaldehidă,
care este toxică, se manipulează cu mănusi si nu se
inhalează. Se recomandă să se lucreze într-o hotă
chimică.
(i) Se încălzesc 9 ml de apă pentru biologie
moleculară (de exemplu, apă ultrapură) la circa 60°C si se
adaugă 0,4 g de paraformaldehidă. Paraformaldehidă se
dizolvă după adăugarea a 5 μlcături de NaOH 1N si
amestecarea pe un agitator magnetic.
(ii) Se ajustează pH-ul la 7,0 prin adăugarea a
1 ml de tampon fosfat 0,1 M (PB; pH 7,0) si 5 picături de HC11 N. Se
verifică pH-ul cu benzi indicatoare si se ajustează, atunci când este
necesar, cu HCI sau NaOH.
Atentie! Nu se foloseste pH-metrul în solutii care contin
paraformaldehidă.
(iii) Se filtrează solutia printr-un filtru cu
membrană de 0,22 pm si se păstrează la 4°C până la
utilizare ferită de praf.
3. Hibmix 3 x
NaCI 2,7 M
Tris/HCI 60 mM (pH 7,4)
EDTA (sterilizată prin filtrare 15 mM
si autoclavată)
Se diluează până la 1 x, după cum este
prevăzut.
4. Solutie de hibridizare
Se prepară cantitătile de solutie de
hibridizare în conformitate cu
4. Solutie de hibridizare
